基于RIF的通用蛋白设计框架

参考文献: Cao L, Coventry B, Goreshnik I, et al. Robust de novo design of protein binding proteins from target structural information alone[J]. bioRxiv, 2021.

解读作者：吴炜坤

一、背景介绍

自从2012年以来，de novo设计靶向结合的蛋白的技术得到了长足的发展。在Rosetta社区过往的一系列文章中，我们可以看出好几个关键技术的交接点，在2020年以前主要以docking-match、motif-graft、fragment重组技术为主，配合酵母展示库的方法对初筛的weak binder进行优化，而在近两年，RIF和深度学习框架厚积薄发，逐渐开始关注全新PPI和高精度的设计方法，其中最具前沿和代表性的工作就是RIF和RFDesign。

那今天我们就主要来讲一讲基于RIF的通用设计框架的工作原理和成功应用的案例。

 二、设计方法

2.1 RIF是什么？

在2011年-2015年期间，产生全新蛋白-蛋白相互作用设计的理念和实践就开始了，但使用的是常规的docking/match-design的方法，其存在最大的问题：hotspot和binding pose的组合空间巨大，通常不能将设计和刚体搜索同时做到， 一般只能先考虑1-3个hotspot的组合并优选少量的初始ppi侧链构象，其次再考虑scaffold和受体之间的粗糙的形状互补后进行热点残基和scaffold和“融合”，最后再通过多轮侧链设计和优化。因此只能在非常小的空间内进行搜索，并且该方法较为依赖多样的scaffold数据库。

而今天介绍的基于RIF（rotamer interaction field）的方法早在2014年间就进行了开发。有兴趣的同学可以看最古老的说明文档的PPT：

Legacy — rif 0.1.dev0 documentation

简单来说RIF分为rifgen和rifdock两个基本的步骤：rifgen负责在某些小分子或热点氨基酸附近以近乎遍历的方式进行rotamer的生成，特别地是使用rif可以针对极性残基也做优化，这些rotamer信息都被储存在hash table中。

rifdock：使用被对接到指定区域的scaffold库作为输入（可以理解为粗略的形状互补搜索），对每一个binding pose的主链xyz信息与rifgen中巨量的inversed-rotamer进行层级逐渐缩小范围的匹配搜索，对clash、rotamer等指标打分进行排名，优选较好的scaffold binding pose。

从此看来，RIF一定程度上解决了需要“同时对接和侧链设计”的痛点，rifgen等于在设计ppi上的残基（“打螺丝”），rifdock负责把预先生成好的稳定scaffold进行“安装”。

 这套方法开发出来后，最先尝试的dou jiayi是在小分子中进行de novo binder设计，详见2018年发表的文章:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6275156/

再后来的故事大家也清楚，cao longxing大神在将此方法改进并发扬光大，并设计了对抗新冠的皮摩尔级亲和力的binder:

https://www.science.org/doi/10.1126/science.abd9909

 

2.2 RIF+MotifGraft横空出世

这套方法流程已经全部概述在下面一张图了。作者这里对新的方法做了一个生动的比喻：将rifgen产生的hotspot-stub比喻为踏脚石，将scaffold比作人，将设计binder比作攀岩的过程，通过地毯式打钉，把人挂在上面，只要挂得住，就把那一系列的好钉子留下，最后通过将高矮胖瘦不同的人去抓这些钉子，从而找到最好的攀岩姿势。

作者提出新的通用设计方法，其主要的亮点在于：

 采用了更高效的helical extension产生高质量三螺旋骨架库（34507个）；

• 由于蛋白-蛋白相互作用主要是疏水的，因此rifgen只考虑疏水的hotspo stub；

• 使用patchdock进行快速的形状互补后，接上rifdock，可以找到ddG和cms指标更好的pose;

• 采用快速的repack+min对rifdock产生的构象进行打分过滤，并且仅考虑Rosetta的疏水相互作用项使得优化速度提升了10倍；

• 在Interface sequence Design中引入cms（the contact molecular surface） score term，在优化时考虑形状互补以及非极性包埋残基，并且在蒙特卡洛过程中upweight处于ppi界面上氨基酸的score，使得PPI的质量进一步提升；

• 将质量好的binding motif（连续的）进行分离以及聚类，这一步相当于隐式地考虑了scaffold pose的体积，同时把最有可能结合的热点残基筛选；（2000个，有点像binding TERMs的操作）

• 采用motif-graft的细化搜索scaffold和展开新一轮的界面设计。

整个流程图（包括实验）：

三、测试效果

 作者在12个蛋白靶点上进行了相关的测试，均成功设计出能够特异性靶向结合的mini binder，少数的binder更是突破了pM级别，这些binder高度稳定，表面具有明显的净电荷分布。

其中部分结构的解析表明，设计出来结合表位和计算机模型高度一致！

结语

作者开源发布所有的rosetta script和database！人人皆可设计binder，或许已经不再遥远。

RIF docking implementation：

• https://github.com/rifdock/rifdock

 design scripts：

• http://files.ipd.uw.edu/pub/robust_de_novo_design_ minibinders_2021/supplemental_files/scripts_and_main_pdbs.tar.gz

• http://files.ipd.uw.edu/pub/robust_de_novo_design_minibinders_2021/ supplemental_files/computational_protocol_analysis.tar.gz

• http:// files.ipd.uw.edu/pub/robust_de_novo_design_minibinders_2021/ supplemental_files/experimental_data_and_analysis.tar.gz

database：

• http:// files.ipd.uw.edu/pub/robust_de_novo_design_minibinders_2021/ supplemental_file s/scaffolds.tar.gz

models：

• http://files.ipd.uw.edu/pub/ robustde_novo_design_minibinders_2021/supplemental_files/design models_pdb.tar.gz

• http://files.ipd.uw.edu/pub/robust_de_novo_ design_minibinders_2021/supplemental_files/design_models_silent. tar.gz