分子对接在酶学性质、底物识别和催化研究中的应用

背景介绍

淫羊藿素是临床上治疗多种癌症有效且安全的候选药物。最近，淫羊藿素的三期抗癌临床研究已经完成，临床安全性得到证实，有望成为世界上第一个治疗肝细胞癌的小分子免疫调节药物。鉴于其良好的药效和巨大的市场应用，人们希望高效生产淫羊藿素。生产淫羊藿素主要分为化学方法和生物方法。化学方法因为复杂的工艺、低产率和环境问题，在工业应用时受到限制。相比而言，生物方法高效而清洁，受到了研究者们的广泛关注。

研究简述

北京化工大学化学资源工程团队从酶开采的角度切入，发现α-L-鼠李糖苷酶（Rhase-I）可以生产淫羊藿素。他们运用实验和计算分析方法对Rhase-I生产淫羊藿素的方法进行了系统的研究，并合理设计、优化了生产方法，为Rhase-I的工业化应用奠定了科技基础。

淫羊藿素主要存在于植物中的黄酮苷类化合物中，如淫羊藿定 A、淫羊藿定 B、淫羊藿定 C、淫羊藿苷。前期的纯化和鉴定实验发现几种鼠李糖苷酶对淫羊藿定 C中鼠李糖苷外键有显著的水解性。通过进一步的生物转化实验，研究者从一株名为T. stollii CLY-6的真菌中发现了一个新的α-L-鼠李糖苷酶（Rhase-I），它可以同时裂解淫羊藿定 C的内、外鼠李糖苷键，有效地将淫羊藿定C转化为淫羊藿素。上述发现提示Rhase-I可以被用于生产淫羊藿素，且具有生产能耗低、生物催化性能高的优势。在这个基础上，研究人员对Rhase-I进行了计算分析，从分子水平上对Rhase-I的酶学性质、底物的识别和催化展开了全面的研究。 依据实验和计算结果，研究者从淫羊藿定 C出发，设计并优化了基于酶的两步催化清洁方法，指导淫羊藿素的“干净”生产。

计算与结果分析

下文针对计算内容展开介绍。研究者首先用RoseTTAFold预测了Rhase-I的3D模型（置信度：0.79）。

操作简述

1. 用RoseTTAFold（基于深度学习的建模方法，与AlphaFold2齐名）预测Rhase-I的三维结构。

2. 用ERRAT、ProSA和PROCHECK等方法对模型进行质量评估。

3. 用WebLogo 3对Consensus Finder生成的同源序列集进行保守分析。

4. 用PyMOL软件对α-L-鼠李糖苷酶（PDB ID：6Q2F，2.2 Å，A链）进行结构叠加。

5. 从PubChem获取淫羊藿苷C（epimedin C）和淫羊藿素（icariin）的三维结构，使用MMFF94力场进行能量最小化处理。

6. 在殷赋云平台上使用DOCK 6.9程序执行半柔性对接和相互作用（结合模式）分析。

结构质量评估（overall quality factor：93.84；Z-score：10.85）显示该预测模型具有较好的有效性和可信度。接着，研究者用PyMOL软件将α-L-鼠李糖苷酶（PDB ID：6Q2F）和Rhase-I模型进行结构叠合和分析。如下图所示，Rhase-I的残基Glu310和Glu452（粉红色）与模板6q2f的催化残基Glu505和Glu643（青蓝色） 具有相似的取向和位置。根据序列保守性分析的结果，研究者推断高度保守的残基Glu310和Glu452是Rhase-I的潜在催化残基。

图1. α-L-鼠李糖苷酶和Rhase-I模型的结构叠加示意图

确定了Rhase-I的潜在催化残基后，研究者采用殷赋云平台（殷赋云 - 科研计算快易准) 的分子对接计算方案，对底物（淫羊藿定 C、淫羊藿苷）和Rhase-I进行了最佳对接姿势的可视化分析。

如图2所示，底物淫羊藿定 C通过氢键与Rhase-I的氨基酸残基Val309、Ile311、Pro312、Thr313、Gln401和Pro407发生结合；而与残基Tyr404、Asn405之间则是疏水作用结合。

图2. Rhase-I与淫羊藿定 C 的结合模式

如图3所示，底物淫羊藿苷与残基Glu310、Tyr404、Pro407和Leu425形成氢键作用，与残基Tyr404、Glu423和Glu434产生疏水作用。这些作用使淫羊藿苷能够紧密结合在Rhase-I的口袋中。

图3. Rhase-I与淫羊藿苷的结合模式

结合图2、3来看，Rhase-I与淫羊藿定 C之间拥有6个氢键作用，这比它和淫羊藿苷结合时形成的4个氢键作用要多，这可能是淫羊藿定 C中存在更多羟基所致。研究者据此推断淫羊藿定 C可能更容易被非催化残基锁定，因此难以接近催化残基。相反，淫羊藿苷（icariin）更靠近残基Glu310和Glu452，因此更容易进入催化中心进行反应，这解释了Rhase-I更倾向于水解鼠李糖部分（rhamnose moiety）与淫羊藿素（icaritin）之间的鼠李糖键的原因。此外，这些与底物相互作用的残基（图2、3）可能是维持Rhase-I活性所必需的，因此被推测为未来对酶修饰时可参考的潜在功能残基。基于上述分析结果，研究者合理设计了先用Rhase-I将淫羊藿定C转化为淫羊藿苷 I，再用葡萄糖苷酶（Bglsk，ACZ20402）催化合成淫羊藿素的两步路线。

案例总结

本研究在实验鉴定的基础之上，通过计算分析，深入探讨了Rhase-I的底物识别和催化机制，为提高Rhase-I酶活性和特异性的蛋白质修饰工作提供了理论指导，在开发微生物资源领域和创新高效清洁的工业生产方法等领域具有重要意义。该成果已经发表在学术期刊Journal of Cleaner Production上。

REFERENCE

Leiyu Cheng, Han Zhang, Haiyang Cui, Jinmei Cheng, Wenya Wang, Bin Wei, Fang Liu, Hao Liang, Xiaolin Shen, Qipeng Yuan, A novel α-L-Rhamnosidase renders efficient and clean production of icaritin, Journal of Cleaner Production, Volume 341, 2022, 130903, ISSN 0959-6526, Redirecting.