SMURF流程之q2-sidle（二）

前面已经完成了qiime2-sidle插件的安装，测试方法就是输入qiime：

  sidle               Plugin for kmer-based marker gene reconstruction.

出现了上面的选项，应该就说明已经安装成功了。

数据库准备

数据库准备是一劳永逸的，前面我们已经完成了数据库过滤的步骤

准备一个区域数据库

这一步是提取一个区域的数据库，基于K-mer，为了提升内存效率，把简并碱基和重复kmer作为一条序列。

# 首先，使用feature-classifier插件的extract-reads提取，那么对于6V区的SMURF应该是：
# 2.2 序列提取
# 74f 315R V1-V2
qiime feature-classifier extract-reads \
 --i-sequences sidle-db-full-degen-filtered-phylum-def-sequences.qza \
 --p-f-primer TGGCGGACGGGTGAGTAA \
 --p-r-primer CTGCTGCCTCCCGTAGGA \
 --o-reads sidle-db-filt-j1.qza
 # 316F 484R V3部分
 qiime feature-classifier extract-reads \
 --i-sequences sidle-db-full-degen-filtered-phylum-def-sequences.qza \
 --p-f-primer TCCTACGGGAGGCAGCAG \
 --p-r-primer  TATTACCGCGGCTGCTGG \
 --o-reads sidle-db-filt-j2.qza
 # 486F 650R V3部分-v4部分
  qiime feature-classifier extract-reads \
 --i-sequences sidle-db-full-degen-filtered-phylum-def-sequences.qza \
 --p-f-primer CAGCAGCCGCGGTAATAC \
 --p-r-primer  CGCATTTCACCGCTACAC \
 --o-reads sidle-db-filt-j3.qza
 # 752F 911 R V5
  qiime feature-classifier extract-reads \
 --i-sequences sidle-db-full-degen-filtered-phylum-def-sequences.qza \
 --p-f-primer AGGATTAGATACCCTGGT \
 --p-r-primer  GAATTAAACCACATGCTC \
 --o-reads sidle-db-filt-j4.qza
 # 901F 1057R V6
  qiime feature-classifier extract-reads \
 --i-sequences sidle-db-full-degen-filtered-phylum-def-sequences.qza \
 --p-f-primer GCACAAGCGGTGGAGCAT \
 --p-r-primer  CGCTCGTTGCGGGACTTA \
 --o-reads sidle-db-filt-j5.qza
 # 1143F 1336R V7 V8
  qiime feature-classifier extract-reads \
 --i-sequences sidle-db-full-degen-filtered-phylum-def-sequences.qza \
 --p-f-primer AGGAAGGTGGGGATGACG \
 --p-r-primer  CCCGGGAACGTATTCACC \
 --o-reads sidle-db-filt-j6.qza

上sidle插件，文档介绍这里和原方法略有区别，原算法是允许2个碱基不一致，而这里用的80%,作者说可以用–p-identity 参数，但是没找到。。。

 # 可以给region起个别名，看喜好起即可
 # P1
 qiime sidle prepare-extracted-region \
 --i-sequences sidle-db-filt-j1.qza \
 --p-region "P1" \
 --p-fwd-primer TGGCGGACGGGTGAGTAA \
 --p-rev-primer CTGCTGCCTCCCGTAGGA \
 --p-trim-length 100 \
 --o-collapsed-kmers sidle-db-P1-100nt-kmers.qza \
 --o-kmer-map sidle-db-P1-100nt-map.qza 
 # P2
  qiime sidle prepare-extracted-region \
 --i-sequences sidle-db-filt-j2.qza \
 --p-region "P2" \
 --p-fwd-primer TCCTACGGGAGGCAGCAG \
 --p-rev-primer  TATTACCGCGGCTGCTGG \
 --p-trim-length 100 \
 --o-collapsed-kmers sidle-db-P2-100nt-kmers.qza \
 --o-kmer-map sidle-db-P2-100nt-map.qza 
 # P3
  qiime sidle prepare-extracted-region \
 --i-sequences sidle-db-filt-j3.qza \
 --p-region "P3" \
 --p-fwd-primer CAGCAGCCGCGGTAATAC \
 --p-rev-primer  CGCATTTCACCGCTACAC \
 --p-trim-length 100 \
 --o-collapsed-kmers sidle-db-P3-100nt-kmers.qza \
 --o-kmer-map sidle-db-P3-100nt-map.qza 
 # P4
  qiime sidle prepare-extracted-region \
 --i-sequences sidle-db-filt-j4.qza \
 --p-region "P4" \
 --p-fwd-primer AGGATTAGATACCCTGGT \
 --p-rev-primer  GAATTAAACCACATGCTC \
 --p-trim-length 100 \
 --o-collapsed-kmers sidle-db-P4-100nt-kmers.qza \
 --o-kmer-map sidle-db-P4-100nt-map.qza 
 # P5
  qiime sidle prepare-extracted-region \
 --i-sequences sidle-db-filt-j5.qza \
 --p-region "P5" \
 --p-fwd-primer GCACAAGCGGTGGAGCAT \
 --p-rev-primer  CGCTCGTTGCGGGACTTA \
 --p-trim-length 100 \
 --o-collapsed-kmers sidle-db-P5-100nt-kmers.qza \
 --o-kmer-map sidle-db-P5-100nt-map.qza 
 # P6
  qiime sidle prepare-extracted-region \
 --i-sequences sidle-db-filt-j6.qza \
 --p-region "P6" \
 --p-fwd-primer AGGAAGGTGGGGATGACG \
 --p-rev-primer  CCCGGGAACGTATTCACC \
 --p-trim-length 100 \
 --o-collapsed-kmers sidle-db-P6-100nt-kmers.qza \
 --o-kmer-map sidle-db-P6-100nt-map.qza 

这步会输出含简并的序列,移除重复序列和一个kmer映射文件，可以qiime可视化，给出原始数据库序列名称(db-seq)、序列名称(seq-name)、区域标识(Kmer)、引物(fwd-primer和rev-primer)、区域(Region)和序列长度(Trim-Length)之间的关系。

# 如果参考序列不能覆盖正反向引物，可以把--p-trim-length设置为负值，增加个参数--p-reverse-complement-result 
 --i-sequences sidle-db-filt-jl.qza \
 --p-region "Batman" \
 --p-fwd-primer TATTACCGCGGCTGCTGG \
 --p-rev-primer TCCTACGGGAGGCAGCAG \
 --p-trim-length -100 \
 --p-reverse-complement-result \
 --o-collapsed-kmers sidle-db-batman-100nt-kmers.qza \
 --o-kmer-map sidle-db-batman-100nt-map.qza