具有DPP-4抑制活性的新型氨甲基联苯衍生物
摘要:本文以联苯化合物A7为先导化合物设计并合成了10个未见文献报道的2-(2,4-二氯苯基)-3-氨甲基-4-取代-6-取代喹啉衍生物(B1~B10),并测定其对DPP-4的抑制率和IC50值。目标化合物通过引入的氮原子和芳香环可增强与酶Arg125和Tyr547残基的作用。其中,B2~B5(IC50=0.080~0.331μmol/L)和B7~B10(IC50=0.104~0.509μmol/L)显示出较好的体外抑制活性,与阳性对照药西格列汀(IC50=0.035μmol/L)相当。
具有DPP-4抑制活性的新型氨甲基联苯衍生物[4],其中,代表化合物A7(图2)表现出较好的活性和一定的选择性:对DPP-4、DPP-7和DPP-8的抑制活性(IC50值)分别为0.082、2.750和0.560μmol/L。化合物A7与DPP-4酶的结合模式显示(图3,绿色),2,4-二氯苯基与母环成垂直构象占据S1口袋,与其中的酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和缬氨酸(Val)的氨基酸残基发生疏水作用;氨基可与谷氨酸(Glu)205/206和Tyr662形成盐桥或氢键作用;三唑环伸向S2口袋与苯丙氨酸(Phe)357发生π-π叠加作用。
根据DPP-4酶腔体特点,S1和S2口袋之间有一个体积较大的空腔,可容纳多环母核结构(图3)。为进一步增强DPP-4的抑制活性,本文对化合物A7进行如下结构改造:①保留2,4-二氯苯基和氨甲基;②在苯环上引入N原子以增强其与精氨酸(Arg)125的作用,同时骈合一个苯环形成喹啉环,增强其与Tyr547的π-π叠加作用;③母环上引入给电子基团(甲氧基或甲基),电子云密度增加有利于π-π叠加作用;④S2口袋结合基团为芳香环,并通过杂原子与喹啉母环相连。
化合物A7以及本研究设计的喹啉衍生物和DPP-4酶结合模式显示A7母环与喹啉母环几乎平行,2,4-二氯苯基、氨基与酶的结合模式基本一致,并且喹啉环较化合物A7拥有更多位置可进行结构修饰,易于引入与DPP-4酶其他氨基酸残基结合的官能团。
根据上述设计思想,本研究设计合成10个未见报道的B类喹啉衍生物(B1~B10),这些新化合物的结构特征如下:①喹啉2-位为2,4-二氯苯基;②3-位为氨甲基;③4-位为S2口袋结合基团——芳香环或芳杂环,并通过杂原子(N、O或S原子)与喹啉母环相连;④6-位为给电基团甲氧基或甲基。B类化合物结构通式如图4所示。为验证所设计化合物的合理性,合成B11~B133个已知喹啉化合物[5],与化合物B1~B10进行比较。
B类化合物是一种多取代喹啉化合物,其合成的关键是喹啉3-位氨甲基和4-位R2基团的引入。本研究以2,4-二氯苯甲酰氯(12)为起始原料,设计以下合成路线(图5)。化合物12与丙二酸二乙酯发生缩合反应得2-(2,4-二氯苯甲酰基)丙二酸二乙酯(13)[6—7],经三氯氧磷氯化得2-[氯(2,4-二氯苯基)亚甲基]丙二酸二乙酯(14),与苯胺化合物经取代反应得中间体15a和15b[8]。然后经高温环合制得2-(2,4-二氯苯基)-4-羟基-6-取代喹啉-3-羧酸乙酯(16a和16b),再经氯代亚砜氯代得关键中间体2-(2,4-二氯苯基)-4-氯-6-取代喹啉-3-羧酸乙酯(17a和17b),然后与亲核试剂(1,2,4-三唑、苯硫酚、4-氟苯硫酚、3-甲氧基苯硫酚或苯酚)发生亲核取代反应得2-(2,4-二氯苯基)-4-取代-6-取代喹啉-3-羧酸乙酯(18a~18j),再经酯基还原得2-(2,4-二氯苯基)-3-羟甲基-4-取代-6-取代喹啉(19a~19j)。19a~19j
可与邻苯二甲酰亚胺发生Mitsunobu反应得2-(2,4-二氯苯基)-3-邻苯二甲酰亚胺甲基-4-取代-6-取代喹啉(20a~20j);也可先与三溴化磷发生溴代
反应,再与邻苯二甲酰亚胺发生Gabriel反应得缩合产物20a~20j[9—10]。较后20a~20j经氨解制得目标化合物2-(2,4-二氯苯基)-3-氨甲基-4-取代-6-取代喹啉(B1~B10),B11~B13的合成方法与B1~B10相似。
本研究对目标化合物的体外DPP-4抑制活性和选择性进行了初步研究。DPP-4酶活测定是利用甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺(Gly-Pro-p-nitroanilide)为底物的发色法,以此评价化合物的活性[11—12]。
本研究采用DPP-4DrugDiscoveryKit试剂盒(EnzoLifeSciences公司)对化合物B1~B13进行体外活性筛选。将B1~B13用DMSO溶解,配制
成浓度为10μg/ml的待测液。B1~B10(10μg/ml)初筛抑制率测定结果均大于50%,而化合物B11~B13(10μg/ml)的抑制率均小于50%,进一步证明目标化合物与酶结合模式的正确性。
再测定初筛抑制率测定结果大于50%的化合物(B1~B10)的IC50值。其中阴性对照、阳性对照西格列汀和被测样品均含DPP-4酶(17.3U/L)15μl,阳性对照、阳性空白对照、被测样品和被测样品空白对照均加入目标化合物待测液10μl,再用50mmol/L的Tris-HCl缓冲液将DPP-4酶和被测样品稀释至50μl,然后于37℃保温10min。测其在405nm处的吸收值,然后加入0.2mmol/L的甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺50μl反应1h,每隔5min测一次OD值。B1~B10每个样品测6个点(浓度依次为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和4.0μg/ml),每个点取3个平行,较终结果取其平均值,并用软件(ICp)处理并计算其IC50值(表1)。
结果显示,除化合物B1和B6,其余化合物均表现出较好的DPP-4抑制活性,与阳性对照西格列汀(IC50=0.035μmol/L)相当。
由于S2口袋为疏水口袋,选取疏水性较强的苯巯基化合物B2和B3进行DPP-4及其同工酶DPP-7和DPP-8酶选择性的初步探究,实验方法同上。结果显示B2和B3的选择性不及A7和阳性对照药西格列汀(表2)。
根据上述活性测试结果可得出以下初步构效关系:
(1)化合物B1~B10(10μg/ml)抑制率均大于50%,其中化合物B5对DPP-4的IC50与A7相当,提示引入喹啉环,可保持抑制活性;
(2)喹啉4-位苯氧基取代活性优于苯巯基(如:B5优于B2、B3和B4;B10优于B7、B8和B9),可能是由于氧原子半径小于硫原子,苯氧基较苯巯基更适合伸入S2口袋;
(3)1,2,4-三唑与喹啉母环直接相连,DPP-4抑制活性明显降低(如B1和B6),提示分子刚性增强,三唑基不能进入S2口袋;
(4)甲氧基给电能力优于甲基,喹啉6-位为甲氧基取代时,喹啉环的电子云密度升高,有利于增强喹啉母环与Tyr547残基形成的π-π叠加作用(如B1~B5分别优于B6~B10)。
上述实验结果显示,化合物B2~B5和B7~B10均表现出较好的DPP-4抑制活性,与阳性对照药西格列汀相当,但同工酶选择性初步探究显示,该类化合物对DPP-7和DPP-8酶的选择性不及阳性对照药。下阶段将通过进一步结构修饰提高化合物的选择性以进行深入研究。
wyf 05.28