一文了解|核体系酵母双杂交建库筛库原理及流程【泰克生物】

酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）技术是一种广泛应用于基因功能研究、蛋白质互作分析和药物筛选的技术平台。核体系酵母双杂交作为该技术的重要发展方向，在研究蛋白质-蛋白质互作、基因功能和信号通路中发挥了巨大作用。本文将重点介绍核体系酵母双杂交的建库和筛库原理及流程，并解析其在生物学研究中的应用。

1. 酵母双杂交筛选原理

酵母双杂交技术的基本原理是基于转录因子激活的原理，将目标基因与转录激活因子（通常是Gal4或其他转录因子）结合，诱导报告基因的表达。具体来说，将目标蛋白分别融合到转录激活域和DNA结合域，并转入酵母细胞。当两种蛋白发生相互作用时，它们会促进转录因子的激活，进而启动报告基因的表达，从而检测蛋白质间的互作。

酵母双杂交筛选是在构建好的酵母双杂交文库基础上，通过选择性培养基筛选出与目标蛋白相互作用的蛋白质。酵母双杂交系统通过对转录因子的激活进行可视化，快速、有效地检测并筛选出潜在的互作蛋白。

2. 核体系酵母双杂交的优势与特点

核体系酵母双杂交系统与传统的酵母双杂交系统相比，具有一些显著优势，特别是在信号转导路径、蛋白质修饰以及大规模筛选的准确性和效率方面。其基本原理与传统酵母双杂交系统相似，但在细胞内的定位和蛋白质-蛋白质相互作用的环境中有所不同。

2.1 核体系酵母双杂交的优势

1).蛋白质定位精准：核体系酵母双杂交将目标蛋白定位到细胞核，能够更好地模拟自然环境下的蛋白质互作。

2).提高了蛋白质相互作用的识别率：核内环境更接近于体内蛋白质的作用场所，有助于识别那些在其他系统中可能难以检测到的弱相互作用。

3).更高的筛选效率和准确性：由于蛋白质能够在细胞核内正常折叠和修饰，核体系酵母双杂交具有更高的筛选灵敏度，适合复杂的蛋白质互作研究。

2.2 应用领域

核体系酵母双杂交广泛应用于功能基因组学、药物筛选、蛋白质互作网络构建以及癌症研究等领域。通过这种技术，研究人员能够识别与特定蛋白质相互作用的候选蛋白，揭示细胞内复杂的信号转导通路和生物学机制。

3. 酵母双杂交建库的流程

酵母双杂交文库的构建是酵母双杂交筛选的前提，它通过将细胞中的cDNA库插入到适合酵母表达的载体中，构建出一个庞大的酵母文库。以下是酵母双杂交建库的基本步骤：

3.1 文库的构建

1).mRNA提取：从目标细胞或组织中提取mRNA，确保其质量和纯度。

2).逆转录合成cDNA：利用逆转录酶将提取的mRNA转录为cDNA，并利用PCR进行扩增。

3).cDNA克隆：将合成的cDNA克隆到酵母表达载体中。常用的载体包含DNA结合域和转录激活域。

4).转化酵母细胞：将含有文库的表达载体转化到酵母细胞中，生成能够表达目标基因的酵母文库。

3.2 酵母双杂交建库的注意事项

1).文库的多样性：确保文库中包含尽可能多的目标基因，以提高筛选的覆盖度。

2).转化效率：确保文库转化的酵母细胞数量足够，保证筛选到有代表性的互作蛋白。

3).选择标记：利用合适的选择性标记基因（如抗生素或氨基酸缺失基因）筛选转化成功的酵母细胞。

4. 酵母双杂交筛库的流程

酵母双杂交筛库是通过筛选酵母文库中与目标蛋白相互作用的基因或蛋白，进而发现潜在的蛋白质-蛋白质相互作用。筛库的流程主要包括以下几个步骤：

4.1 筛选过程

1).转化酵母文库：将构建好的酵母双杂交文库转化到酵母细胞中。

2).诱饵蛋白表达：在酵母中表达诱饵蛋白，该蛋白通常与DNA结合域融合。

3).猎物蛋白筛选：通过文库筛选，找出能够与诱饵蛋白结合的猎物蛋白。

4).报告基因检测：在筛选过程中，通过报告基因（如lacZ或HIS3）来检测蛋白质的相互作用。当诱饵蛋白与猎物蛋白结合时，报告基因会被激活，显示出可检测的信号。

5).克隆与鉴定：筛选出的酵母细胞会被单克隆，进一步分析其互作的蛋白，并通过DNA测序确认基因信息。

4.2 筛库中的挑战

1).假阳性问题：在筛选过程中，可能会遇到假阳性的问题。可以通过多轮筛选和使用不同的选择性培养基来降低假阳性。

2).低亲和力的相互作用：对于一些低亲和力的蛋白质-蛋白质互作，可能需要优化筛选条件，以提高筛选的灵敏度。

3).酵母表达系统的限制：某些蛋白质在酵母中可能无法正确折叠或表达，这可能会影响筛选结果。针对这种情况，可以考虑优化文库构建或使用其他筛选系统。

核体系酵母双杂交系统为研究蛋白质-蛋白质相互作用提供了一个高效、精准的工具。通过酵母双杂交建库和筛库，研究人员能够发现潜在的蛋白质互作网络，揭示细胞内复杂的信号通路和生物学机制。随着技术的不断优化，酵母双杂交系统的应用将在功能基因组学、药物筛选和疾病研究等领域发挥越来越重要的作用。

酵母双杂交系统是解析蛋白质-蛋白质相互作用的重要工具。泰克生物的酵母双杂交服务，通过诱饵和猎物蛋白的表达，能够有效地筛选出两种蛋白质之间的相互作用。这项技术适用于大规模筛选潜在的互作蛋白，特别是在基因功能研究、信号通路分析等领域中有着广泛应用。通过不断优化文库构建和筛选条件，泰克生物能够大大提高酵母双杂交技术的筛选效率，帮助科研人员发现新的互作关系，为深入研究生物学过程提供新的思路。

参考文献

1. Fields, S., & Song, O. (1989). A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 340(6230), 245-246.

2. Chien, C. T., et al. (1991). Isolation and characterization of genes that encode target proteins for the yeast G-protein alpha subunit. Science, 252(5007), 1472-1476.

3. Uetz, P., et al. (2000). A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature, 403(6770), 623-627.

4. Vyas, S. K., & Auer, T. (2001). Yeast two-hybrid: A powerful tool for studying protein-protein interactions. Journal of Clinical Investigation, 108(5), 681-688.

5. Ren, M., et al. (2003). Membrane protein interactions: New insights and methods. Biochimica et Biophysica Acta, 1610(2), 135-146.