AbMole|解密体内免疫肽组揭示新的肿瘤特异性抗原

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由Alex M. Jaeger, Lauren E. Stopfer, Ryuhjin Ahn等人在“Nature”上发表的名为“Deciphering the immunopeptidome in vivo reveals new tumour antigens”的文章，在该文章中，使用了AbMole的CHIR99021（M1692）、PD0325901（M1763）的2种产品。 

癌症的免疫治疗近年来取得了显著进展，其核心在于通过激活机体自身的免疫系统来识别和攻击肿瘤细胞。这一过程依赖于主要组织相容性复合体I类（MHC-I）分子在细胞表面呈递的肽抗原，这些肽抗原通常由肿瘤细胞内蛋白质的降解产生。然而，当前对MHC-I相关肽（即免疫肽组）的研究主要依赖于体外实验或肿瘤裂解物分析，这些方法往往忽略了体内微环境对肽抗原呈递的复杂影响。为了更深入地理解体内肿瘤特异性抗原的呈递机制，研究人员设计并验证了一种新型小鼠模型，该模型能够在体内精确分离MHC-I肽，并揭示了多种新的肿瘤抗原。

癌症免疫监视依赖于免疫系统对肿瘤细胞表面MHC-I分子上呈递的肽抗原的识别。然而，现有的MHC-I肽组研究方法多局限于体外细胞培养或肿瘤裂解物分析，这些方法难以全面反映体内复杂的生理环境和肿瘤特异性。因此，研究人员设计了一种在小鼠MHC-I基因中插入诱导型亲和标签的方法，以实现在体内精确分离和鉴定MHC-I肽，进而揭示肿瘤特异性抗原的呈递机制。

研究人员首先在小鼠MHC-I基因（H2-K1）内含子1中插入了一个Cre可诱导的外显子，该外显子编码高度特异性的亲和标签StrepTagII。这一设计使得在Cre重组酶的作用下，StrepTagII会被整合到成熟的H2-K b蛋白的N端，从而允许通过StrepTactin亲和树脂特异性地纯化带有StrepTagII的MHC-I肽。随后，这一K b Strep等位基因被靶向整合到携带Kras LSL-G12D/+Trp53fl/fl（KP）基因型的小鼠胚胎干细胞中，从而建立了可用于研究体内肿瘤特异性抗原呈递的新型小鼠模型。

图1 KPKbStrep小鼠模型的设计与验证

为了研究胰腺癌（PDAC）和肺腺癌（LUAD）的免疫肽组，研究人员通过不同的途径在KP小鼠中诱导了肿瘤。对于PDAC，通过胰腺导管内逆行注射表达Cre重组酶的腺病毒，诱导了自发生成的胰腺癌。对于LUAD，则通过气道内给予表达Cre重组酶的腺病毒，在KP小鼠中诱导了肺腺癌。在肿瘤诱导成功后，研究人员采集了不同时间点的肿瘤样本以及相应的正常组织样本，用于后续的MHC-I肽分离和分析。

图2  LUAD免疫肽球在整个肿瘤进化过程中是动态和异质性

图3 LUAD特有肽的转录和翻译

为了精确分离MHC-I肽，研究人员采用了抗体免疫沉淀（Ab-IP）和StrepTactin亲和纯化两种方法。抗体免疫沉淀方法使用特异性抗体结合MHC-I分子，从而分离出与之结合的肽段。而StrepTactin亲和纯化方法则利用StrepTagII与StrepTactin之间的高亲和力，特异性地纯化出带有StrepTagII的MHC-I肽。分离得到的肽段随后通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析，以确定其序列和特性。

图4 LUAD中新肿瘤抗原的发现

通过比较体外培养的细胞、原位移植的肿瘤以及自发生成的肿瘤中MHC-I肽的组成，研究人员发现体内特异性分离的MHC-I肽覆盖了更广泛的免疫肽组。特别是，通过StrepTactin亲和纯化鉴定出的多种肽段仅在体内肿瘤样本中特异性出现，这表明体内微环境对MHC-I肽的呈递具有重要影响。

为了进一步探究体内MHC-I肽的细胞类型特异性，研究人员利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析了健康肺组织和肿瘤组织中基因表达谱的差异。结果表明，通过StrepTactin亲和纯化的MHC-I肽强烈反映了肺泡2型（AT2）细胞的特征，这表明这些肽段主要由AT2细胞呈递。相比之下，抗体免疫沉淀得到的肽段则包含多种细胞类型的污染，进一步验证了体内特异性分离方法的优越性。

随着LUAD的进展，研究人员发现肿瘤免疫肽组逐渐偏离了正常AT2细胞的特征。通过基因集富集分析（GSEA），他们发现晚期肿瘤肽签名与胃癌上皮模块和高度混合转录模块的相关性显著增加，而与AT2模块的相关性显著减少。这表明肿瘤在进化过程中发生了显著的免疫逃逸机制转变，进而影响了MHC-I肽的呈递模式。

通过质谱分析，研究人员在LUAD样本中鉴定出了135种非突变肿瘤特异性抗原（TSA）和147种肿瘤相关抗原（TAA）。为了验证这些抗原的免疫原性，他们选择了其中部分抗原制备了疫苗，并通过骨髓衍生的树突状细胞（BMDC）接种给小鼠。结果表明，多种TSA和TAA在疫苗接种后成功诱导了显著的CD8+ T细胞反应。特别是PRDM15来源的肽SVAHFINL在肿瘤组织中特异性地诱导了强烈的T细胞反应，进一步证实了其在肿瘤免疫治疗中的潜力。

尽管mRNA表达水平和预测亲和力在一定程度上可以指导MHC-I肽的筛选和验证工作，但研究人员发现许多肿瘤特异性肽的呈现并不能完全通过这些因素来解释。为了进一步探究抗原呈递的分子机制，他们利用核糖体分析（Ribo-seq）技术研究了相关基因的翻译效率变化。结果表明LUAD特异性肽的基因在肿瘤中表现出显著的翻译效率变化，这提示翻译后修饰在抗原呈递过程中发挥了重要作用。此外他们还发现LUAD特异性肽的来源蛋白在稳定性和细胞定位方面也存在差异进一步支持了翻译后修饰对抗原呈递的影响。

本研究通过体内精确分离MHC-I肽的方法揭示了肿瘤免疫肽组的复杂性和动态变化性。研究结果表明体内外MHC-I肽的组成存在显著差异且受肿瘤微环境影响显著；同时研究还发现了多种新的肿瘤特异性抗原并验证了其免疫原性。这些发现不仅加深了对肿瘤免疫逃避机制的理解还为开发更有效的肿瘤免疫疗法提供了科学依据和潜在靶点。未来研究将进一步探索不同肿瘤类型和阶段的免疫肽组特征以及翻译后修饰在抗原呈递中的作用机制以期为肿瘤免疫治疗开辟新的途径和方法。

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