宏病毒组的研究背景与组成

1. 宏病毒组的研究背景
   被称为人体第二基因组的人体微生物组((human microbiome)是人体内外表面所有微生物所携带遗传物质的总称(Sender R, et al, 2016)。全球各国对这一新兴领域异常重视，并启动了多项微生物组研究计划，例如，由法国农业研究院2005牵头发起并于2008年正式成立了国际人体微生物组联盟；2008年，由美国国立卫生研究院主导启动了人体微生物组计划(Human Microbiome Project, HMP)(Methé Barbara A, et al, 2012)；及欧盟于2008年启动的“人体肠道微生物宏基因组学(Metagenomics of Human Intestinal Tract MetaHIT)计划”，在其第七框架计划下，欧盟将目光聚焦在了特定的微生物组领域。这些计划的开展，揭示了人体微生物复杂的组成成分(图1)，包括细菌、真菌、人感染病毒、专一性感染细菌的噬菌体等，这些微生物之间相互作用，维持人体内环境的动态平衡，影响着人体的健康。
   
   图1 人体微生物组的主要组成成分(Rowan-Nash AD, et al, 2019)

   随着肠道基因组学、代谢组学、蛋白质组学的不断发展，人们开始将目光转向人类肠道中体积远远小于细菌，自身结构中又无细胞核的病毒身上，目前，病毒组的研究迎来了崭新的阶段，高通量测序技术和生物信息分析方法的发展为病毒组学的研究提供了必要的支持，使系统水平的复杂微生物群落研究不再是天方夜谭。
   1.1宏病毒组简介
   1991年Schmidt(Schmidt TM, et al, 1991)首次提出的环境基因组学(Environmental genomics)被视为宏基因组学的前身，当时Schmidt等构建了世界上第一个海洋生物样本DNA的噬菌体文库，并从中发现了15种全新的细菌核酸序列。1998年，Handelsman等(Handelsman J, et al, 1998)提出研究特定环境样本中遗传物质的总和的课题，并将特定小生境中全部微小生物遗传物质的总和定义为宏基因组(Metagenome) 。2004年Handelsman (Handelsman J, et al, 2004)完整阐述了宏基因组学(Metagenomics)的概念，即以某一特定环境样本中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和序列测定分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互作用及其与环境之间的关系为研究目的的一种新的微生物研究方法。
   宏病毒组学(Viral Metagenomics)是宏基因组学的一个分支，但与传统的宏基因组学概念不同，它是在宏基因组学概念的基础上，结合病毒自身的特点，将宏基因组学方法应用到病毒学领域而形成的。2002年，Breitbart等(Breitbart M, et al, 2002)将宏基因组学方法应用于海洋病毒群落的研究，发现噬菌体为海水中主要病毒组，这一研究标志着宏病毒组学正式应用于科学研究。
   简而言之，宏病毒组学就是应用特殊方法把特定环境中所有病毒与其他微生物分开，然后提取的病毒核酸，用高通量技术进行病毒核酸测序，最后将测序结果与现有的核酸文库进行比对，并运用软件分析处理后最终得到研究样品中病毒群落的组成信息。
   1.2 宏基因组时代下的病毒组
   1.2.1 病毒的组成与分类
   病毒是地球上数量最多的生物实体，其中细菌病毒(即噬菌体)约有1031个种群，从海洋到陆地再到人体几乎都是它们的栖息地。研究者将病毒视为调节人类生态系统的重要成员，人体内主要包括真核病毒和噬菌体，包括双链DNA (double-stranded DNA, dsDNA)，单链DNA (single-stranded DNA, ssDNA)和RNA病毒。随着对病毒研究的广泛开展，“病毒组”与“病毒组学”的概念也应运而生，这些术语分别涵盖了栖息在生态系统中的所有病毒及其基因组和对它们的研究(Lefkowitz EJ, et al, 2017)。根据病毒不同的特征进行分类，包括病毒的宿主范围；病毒的形态学；病毒的基因组大小；病毒的核酸组成成分以及病毒的致病性(图2)。虽然所有的性状在病毒分类学的确定中都很重要，但目前利用平均核苷酸同源性（ANI）和系统发育关系进行序列比较被视为定义和区分病毒群类的主要标准。
   
   图2 基于不同特征对病毒进行分类(Garmaeva S, et al, 2019)

   此外，病毒也被发现潜伏在人类细胞内，如人类内源性逆转录病毒(human endogenous retroviruses, HERVs)，原病毒，或外鞘。一部分病毒已经失去了重新激活的能力(例如某些HERVs)，另一部分可以重新激活但作为原病毒保留很长一段时间，其它部分则呈现周期性的动态循环(周期性产生病毒颗粒并频繁感染)。
   另一方面，噬菌体通过与我们体内细菌群落的相互作用，从而可以参与调节人体菌群，对细菌的部分功能基因进行储存，并通过与机体免疫系统的互作，促进免疫系统的成熟(图3)。
   
   图3 人类病毒组(Forterre, et al, 2017)

   已有大量研究致力于描述病毒群落的特征及它在塑造微生物群方面的作用，然而，不同于细菌和真菌，噬菌体或真核病毒并没有通用的标记基因可以将其作为一个整体进行研究，因此，宏基因组方法经常被使用，宏基因组测序和透射电镜技术的研究证实，人体内外已发现 的病毒多数为噬菌体(包括肠道、口腔、皮肤、呼吸道和尿道, 其中对肠道的研究最多)(Lee SC, et al, 2014)。对人体肠道病毒组的相关研究首次见于2003年，研究者通过鸟枪测序法对分离自健康成人粪便的病毒颗粒物进行了测序，该研究估计成人粪便样品中大约有1200种病毒，其中多为长尾噬菌体科（Siphoviridae)。
   1.2.2 噬菌体:生态系统中的动态参与者
   噬菌体是数量最多的一种病毒，被视为在细菌宿主中繁殖的强制性寄生虫。其潜在的宿主范围是噬菌体特异性所决定的，从一个菌株到多种细菌种类不等。在感染过程中，噬菌体附着于细菌表面，并将自己的遗传物质插入细胞。然后，噬菌体遵循两种主要生命周期之一:溶解周期或溶原周期(Mao Ye, et al, 2019)
   
   图4 噬菌体在溶解和溶原循环中的作用 (Mao Ye, et al, 2019)

   溶解周期对宿主细胞是致命的，并最终产生新的噬菌体，具有溶解周期病毒的最著名例子是以感染大肠杆菌为主的T7和Mu噬菌体。这些噬菌体最初侵入了细菌细胞，制造病毒颗粒；随后细菌细胞被裂解，释放100-200个病毒颗粒到周围环境中，可以持续感染新的细菌细胞。由此，噬菌体可以在调节宿主细菌丰度方面发挥重要作用。
   相反，溶原循环指的是噬菌体复制，该过程不会直接导致病毒颗粒的产生。噬菌体通过溶原性转化或转导的方式将基因从一个细菌转移到另一个细菌，这种能力可以使得病毒种类及其相关细菌宿主种类的多样性增加。溶原循环的发生，可以介导细菌中的毒素、毒力基因、甚至抗生素抗性基因在细菌种群中传播。温和噬菌体中相对最著名的例子就是霍乱弧菌的CTXφ噬菌体，该噬菌体可以通过在宿主中插入引起腹泻的毒素编码基因，从而改变细菌宿主的毒性。但是在某些条件下，比如DNA损伤或低养分条件(紫外线、温度、辐射、抗斑点剂、重金属等)，这些噬菌体可以自发地从宿主基因组中分离出来(这种分离被称为诱导分离)，而后进入裂解循环。
   Referrences:
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   Rowan-Nash AD, Korry BJ, Mylonakis E, et al. Cross-Domain and Viral Interactions in the Microbiome[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2019, 83(1): e00044.
   Sender R, Fuchs S, Milo R. Revised Estimates for the Number of Human and Bacteria Cells in the Body[J]. PLoS Biology, 2016.14(8), e1002533.
   Ye Mao, Sun Mingming, Huang Dan, et al. A review of bacteriophage therapy for pathogenic bacteria inactivation in the soil environment. Environment International, 2019, 129: 488-496.
   Schmidt TM, DeLong EF, Pace N R. Analysis of a marine picoplankton community by 16SrRNA gene cloning and sequencing[J]. J Bacteriol, 1991,173 (14):4371-4378.

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