儿科肠炎与病毒和微生物组

1分钟概述：
课题设计：

选取克罗恩病（CD）儿童7例，溃疡性结肠炎（UC）儿童5例，其平均年龄为12.2岁，作为实验组；同时选取年龄相似儿童12例，作为健康对照组；采集粪便样品进行处理，拟通过分析肠道病毒组和细菌群落组成，分析儿科炎症性肠病（IBD）致病性相关的病毒和微生物组成特征，探究发病机理。

方法：

• 宏病毒组：
  粪便样品通过过滤去除细菌和宿主细胞污染，进一步通过DNase和RNase酶切消化，分离获得病毒颗粒，病毒RNA提取后进行反转录和二链合成，构建二代测序文库，测序数据通过翻译蛋白序列相似性搜索，鉴定病毒序列。
• 微生物组： 提取粪便微生物基因组DNA，通过对16S rRNA基因的V4区域进行靶向扩增，扩增产物测序分析细菌菌群。

结果：

检测到少数人类病毒，病毒分析主要针对细菌病毒开展。IBD和健康对照中有尾噬菌体的相对丰度均大于微小噬菌体。 相比于对照，有尾噬菌体在CD中的含量（平均80.8％）比UC（48.8％）丰富（p = 0.05）。 相对于UC，微小噬菌体病毒丰富度高于CD（p = 0.05）。细菌菌群分析显示，IBD诊断，白蛋白，血红蛋白，红细胞沉降率和益生菌补充与肠道细菌菌群的组成有关。

新发现：

• 在克罗恩病、溃疡性结肠炎和非IBD对照组的儿童中，无论疾病状态如何，有尾噬菌体目病毒相对于微小噬菌体丰度更高，更富集和多样。
• 肠道病毒组和细菌群落组成的轻微变化将小儿IBD患者与健康对照组区分开来。
• 益生菌与IBD儿童的细菌微生物群组成有关。

正文内容：
背景简介

小儿炎症性肠病（IBD）是儿童的慢性病，在世界范围内发病率正在增加。 尽管目前的研究表明IBD的发病机制是多因素的，包括遗传，环境和自身免疫因素，但IBD的病因仍是一个谜。 据报道，包括细菌，真菌和病毒在内的肠道微生物组在IBD的发病机理中起重要作用。 已发现IBD患者中存在不同的肠道微生物群落，但是来源和如何形成这种差异性菌落的原因尚不清楚。肠道病毒与其他因素结合，例如微生物组，宿主遗传学和免疫状态，被认为是通过影响肠道和免疫发育以及慢性炎症反应来影响疾病严重程度的调节因素。

病毒性肠病的发病机理研究日益深入，这将为肠病的发病机理研究提供依据。已发表的文献侧重于描述肠道病毒组的组成，分析IBD患者之间是否存在任何共同性差异。例如通过对三个成人IBD队列（12个健康对照； 18个克隆氏病；42个溃疡性结肠炎）的肠道病毒组进行特征分析发现，与正常对照组相比，成年IBD患者有尾噬菌体的相对序列丰度更高。亦有文献研究肠道组织RNA而非粪便样本，证明成年IBD患者与健康对照组的哺乳动物病毒和内源性逆转录病毒序列的reads存在差异。最近一项关于粪便菌群移植（FMT）的研究表明，UC患者的噬菌体丰富度在FMT前后的任何时间点与健康对照组没有差异。然而，与健康对照组相比，UC患者的真核生物病毒丰富度更高，无应答者与FMT应答者相比也更高。检测到的真核病毒主要与已知感染人类的Anelloviridae和Picobirnaviridae相匹配，Virgaviridae感染植物，以及未知向性的环状病毒科。

噬菌体类群中病毒的相对丰度和丰富度因受试群体而异。

MiSeq测序产生了8.3x106 的250bp配对末端reads。在真核病毒中，我们检测到低丰度dsRNA核酸病毒，picobirnaviruses（133条reads，2例病例和1例对照）、ssDNA细小病毒bufavirus（15条 reads，1例对照）、ssDNA指环病毒（10 条reads，1例病例）、ssDNA circo-like病毒（4条reads，1例病例）和ssDNA环病毒（1条reads，1个对照）。在所有受试者的粪便中均检测到属于ssDNA微小噬菌体和dsDNA有尾噬菌体。由于真核生物病毒序列检测的数量和频率较低，作者将重点放在细菌病毒的序列分析上。IBD组和对照组有尾噬菌体科的相对丰度、富集和Shannon多样性始终高于微小噬菌体科。有尾病毒噬菌体在CD中的相对性显著高于UC患者（平均值为80.8%）和UC患者（平均值为48.8%）（图1a，Dunn检验；P=0.05），CD的相对性高于对照组（平均55.0%；Dunn检验；P=0.07）。而在对照组中检测到的微小噬菌体数量明显高于CD患者，并且与UC患者相比呈上升趋势（图1b，Dunn检验；P=0.05，P=0.1），在微小噬菌体或有尾噬菌体的三个受试者组之间，Shannon多样性指数没有差异（图1c）。

图1. 不同病毒在CD组、UC组和健康对照组差异性比较

疾病状况，主要细菌类群和益生菌补充与肠道细菌微生物群组成有关。

由于12名IBD患者中仅9名患者获得了足够深度的测序数据（每个样品85,486条reads），因此将这些参与者合并为一个IBD组。使用丰富度，Pielou的均匀度和Shannon的多样性指数评估组间细菌的α多样性发现，健康受试者和IBD患者之间的α多样性没有显著差异（Wilcoxon rank-sum test，p>0.05），尽管对照组与实验组相比，更趋向于富集肠道微生物。PERMANOVA分析用于检验细菌群落组成的变化是否由临床特征决定，包括益生菌补充和炎症标志物。在检查的因素中，IBD诊断、健康状况的多个标志物（白蛋白、血红蛋白和红细胞沉降率）以及益生菌补充与肠道细菌菌群的组成显著相关（表2）。尽管抗生素治疗是一个潜在的混杂因素，但服用抗生素的对照组与其余对照组聚集在一起，表明服用抗菌药物并没有显著改变该参与者的微生物群组成。值得注意的是，优势菌家族解释了肠道菌群组成变化的最大程度（图2），而在这些样本中检测到的优势噬菌体与群落组成没有显著关系。这些数据表明，我们研究中的儿童参与者的健康状况与其肠道微生物群的组成有关，并且益生菌补充剂影响肠道细菌群的组成。

图2. 优势菌群组成很大程度上阐明了儿科粪便微生物组成的差异

表2 细菌 Beta多样性

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