易基因｜亮点研究：单细胞组学测序技术揭示水稻受精过程DNA甲基化重塑机制

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2021年9月6日，华中农业大学周道绣教授课题组以“DNA demethylases remodel DNA methylation in rice gametes and zygote and are required for reproduction”为题在《Molecular Plant》期刊发表研究论文，该研究利用单细胞DNA甲基化组和单细胞转录组测序技术对水稻受精前后的雌雄配子体和合子（zygote）细胞进行高通量测序分析，揭示了水稻受精过程中DNA甲基化的重塑机制。

标题：DNA demethylases remodel DNA methylation in rice gametes and zygote and are required for reproduction

发表时间：2021年9月6日

期刊：Molecular Plant

影响因子：IF 13.164

技术方法：单细胞全基因组重亚硫酸盐测序（scWGBS）、单细胞转录组测序（scRNA-seq）等（易基因均可提供）

研究摘要：

受精作用是有性生殖生物生命周期的开端，在该过程配子基因组通常会经历染色质的动态变化。大量研究表明哺乳动物早期胚胎发育过程中，亲代染色质上的DNA甲基化会被DNA去甲基化酶擦除（erasure），随后进行广泛地重编程过程。然而，对于开花植物生殖发育过程中是否存在与哺乳动物相似的DNA甲基化重编程过程目前尚不清楚。在本研究中，研究人员通过显微操作分离水稻雌雄配子和合子细胞进行单细胞DNA甲基化组和转录组测序，分析了水稻受精过程中的DNA甲基化动态变化，并深入分析了DNA糖基化酶在雌雄配子、单细胞合子及胚胎发生过程中的功能。研究发现，相对于雌雄配子，受精6.5小时的水稻合子基因组上发生了一定程度的区域性的甲基化重塑。遗传学、表观基因组学和转录组学分析显示，三种水稻DNA去甲基化酶DNG702、DNG701和DNG704在配子体和合子细胞的不同基因组区域DNA去甲基化，且是合子基因表达和发育所必需。总之，结果表明，水稻受精过程中配子和合子细胞中发生了活跃的DNA去甲基化，以部分重塑DNA甲基化，这对水稻雌配子（卵子）和合子基因的表达和生殖至关重要。

图：受精前后全基因组DNA甲基化重塑模型

方法：

本研究采用水稻品种DongJin（DJ），分别创建DNA去甲基化酶DNG702单突变体和DNG701/DNG704双突变体(DNG701/4)。水稻在温室或稻田中生长，通过显微操作从受精前后的水稻花粉中分离雌雄配子、合子细胞和胚胎进行单细胞DNA甲基化组和转录组测序。

结果：

（1）受精过程中的DNA甲基化动态变化

作者通过显微操作分离水稻雌雄配子和合子细胞进行DNA甲基化组和转录组测序，分析了水稻受精过程中的DNA甲基化动态变化。研究发现，相对于雌雄配子，受精6.5小时的水稻合子基因组上发生了一定程度的区域性的甲基化重塑。在受精3天的球形胚到成熟胚的发育过程中DNA甲基化重塑则涉及更广泛的基因组区域，DNA甲基化重塑的位点主要集中在基因组上编码 24 nt siRNA的区段。

图1：水稻配子、合子、球形胚和成熟胚中的DNA胞嘧啶甲基化

1. 水稻雌配子（E）、雄配子（S）、合子（Z）、球形胚（GE，授粉后3天）、成熟胚（ME，授粉后7天）和幼苗（Se）的基因和转座因子（TE）中的总胞嘧啶甲基化水平（mCG、mCHG和mCHH）箱形图
2. 50bp部分甲基化水平分布差异
3. TE、基因（Gene）和基因间（intergenic）区域50 bp的差异甲基化区域（DMR）数量比较
4. 雌配子（E）、雄配子（S）和合子（Z）中mCG，mCHG和mCHH的Genome Browser屏幕截图

（2）水稻DNA去甲基化基因在生殖中的作用

为了探究在水稻生殖发育过程中甲基化动态变化机制，作者分别创建了DNA去甲基化酶DNG702的单突变体和DNG701/DNG704的双突变体(dng701/4)，遗传分析发现DNG702突变以后不能产生可育的胚，而DNG701、DNG704突变以后则会导致部分种子的胚发育迟缓或败育。由此表明，水稻去甲基化酶在合子起始（ZGA）以及胚发育过程中起着重要作用。

图2：编码DNA去甲基化酶基因突变对种子和胚胎发育的影响

1. 与野生型（WT）植物相比，dng702和dng 701/4的结实率
2. 在每个基因型中观察到的三种种子类型的百分比

C和D. 授粉前（BP）和授粉后1-5天（DAP）的dng702（C）和dng701/4（D）卵巢表型。红色箭头表示败育，橙色箭头表示胚胎发育迟缓

（3）DNG702和DNG701/4在配子和合子DNA甲基化中的作用

为了进一步探究DNA去甲基化酶的分子生物学功能，研究人员检测了DNG702和DNG701/4突变体雄配子细胞、雌配子细胞以及合子细胞的全基因组甲基化水平，研究显示DNA去甲基化酶调控配子和合子基因组不同区间的DNA甲基化水平，且参与受精后合子基因组DNA甲基化重塑过程。

图3：DNG蛋白在水稻配子和单细胞合子中DNA去甲基化

1. 雌配子（E）,雄配子（S）,合子（Z）在野生型（WT）、CRISPR阴性（crWT）、dng702突变（702）、dng702杂合子（702(+/-)）、dng701/4突变（701/4）中的Gene（上）和TE（下）区域箱形图。每种基因型两个重复。
2. 去除crWT–WT DMR后，指定突变细胞中与WT差异甲基化区域（DMR）数量比较。
3. dng702和dng701/4雌配子DMR重叠
4. dng701/4雌配子和合子DMR重叠

（4）DNG702和DNG701/4在受精后DNA甲基化动态变化中的调控作用

转录组学分析和遗传学证据表明DNA去甲基化酶在水稻配子和合子细胞中调控的DNA甲基化的动态变化，同时对雌配子和合子细胞的基因表达具有调控作用，并影响受精后的合子基因组激活（ZGA）和之后的发育过程。

图4：雌配子中被DNG蛋白去甲基化的基因组区域在合子中重新甲基化

1. dng702和野生型（WT）雌配子在50 bp的CG、CHG和CHH甲基化差异分布
2. 上图：A中突变体中高甲基化区域（粉红色到红色）密度图，以及WT中雌配子和合子间的甲基化差异。下图：所有区域（Z-E）和B中有色区域的雌配子和合子甲基化差异箱形图
3. WT雌配子与合子高甲基化比较，dng702和dng701/4卵子高DMR数量。

D． Z-E 高甲基化区域在 dng702 雌配子（卵细胞）中高甲基化屏幕截图示例

图5：雌配子基因组中的高甲基化区域被合子中的DNG701/4去甲基化

A．dng701/4和野生型（WT）合子之间50 bp处的CG、CHG和CHH甲基化差异分布。

B．上图： A中鉴定的突变体高甲基化区域（粉红色-红色）的分布图，以及WT中合子和卵子之间的甲基化差异。下图：所有区域（Z-E）和上图中着色的区域合子甲基化差异箱形图。

C．WT雌配子与合子低甲基化比较， dng701/4卵子高DMR数量。

D．Z-E 低甲基化区域在 dng701/4合子中高甲基化屏幕截图示例

图6：DNG基因在调控卵子和合子基因表达中的作用

结论：

该研究结果表明，与哺乳动物不同，水稻配子和合子基因组DNA似乎不存在广泛的去甲基化过程，只有区域性DNA甲基化进行重塑。在此过程中DNA去甲基化酶发挥关键性作用，与此同时，这些DNA去甲基化酶通过控制DNA甲基化重塑影响卵细胞和合子特异表达基因的转录水平及发育过程。该研究对于解析植物 DNA 甲基化修饰在生殖过程中的传递与重建机制及其对基因表达和生殖发育的表观调控具有重大意义。

关于植物单细胞DNA甲基化测序

单细胞及微量样本的DNA甲基化组学研究很大程度上受制于建库技术。传统的文库构建方法或类似于基因组DNA的单细胞扩增技术很难应用到甲基化实验过程中。易基因建立了一系列微量及单细胞甲基化检测方法，可对于不同项目需求，个性化提供检测方案，在全基因组、简化基因组、靶基因等范围开展甲基化检测。

易基因建立的单细胞及微量样本DNA甲基化测序技术包括：

• 单细胞全基因组甲基化测序（scWGBS）
• 微量样本全基因组甲基化测序（Micro DNA-WGBS）
• 微量细胞或DNA简化基因组甲基化测序（Micro DNA-XRBS）

技术优势：

1）微量细胞或单细胞全基因组甲基化测序（Micro DNA-WGBS）DNA起始量：

单细胞/100-1000个细胞

1ng基因组DNA

90%以上基因组CG覆盖

2）微量细胞或DNA简化基因组甲基化测序（Micro DNA-XRBS）DNA起始量：

1ng基因组DNA；

物种测序数据量评估

技术指标：（数据来源易基因）

技术类型	起始量	特点	覆盖度
常规WGBS	1μg gDNA	正常BS建库技术	95%
Micro DNA-WGBS	1-10000个细胞/1ng基因组DNA	在常规WGBS技术上进行技术改进，使得起始量大大降低，适合珍稀样本的研究	95%
scWGBS	单细胞/1-10个细胞	克服了组织内部细胞异质性的影响，可以满足单个细胞层面的课题研究	NA
Micro DNA-xRBS	1ng gDNA、单细胞	为Micro DNA-WGBS的简化版本，特别适用于大样本量的珍稀样本DNA甲基化研究	NA

参考文献：

Zhou S, Li X, Liu Q, Zhao Y, Jiang W, Wu A, Zhou DX. DNA demethylases remodel DNA methylation in rice gametes and zygote and are required for reproduction. Mol Plant. 2021 Sep 6;14(9):1569-1583.

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