RNA-seq 详细教程：count 数据探索（4）

生信小宝

已于 2024-07-28 21:14:29 修改

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文章标签：服务器数据库 linux

于 2024-07-28 11:13:28 首次发布

原文链接：https://github.com/twbattaglia/RNAseq-workflow "Source"

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RNA-seq 详细教程：count 数据探索（4）

学习目标

了解 RNA-seq count 数据的特征
比较 count 数据的不同数学模型
确定最适合 RNA-seq count 数据的模型
了解设置生物学重复对于鉴定样本间差异的好处

1. 计数矩阵

当开始差异表达基因分析时，先从一个矩阵开始，该矩阵总结了数据集每个样本中的基因水平表达。矩阵中的行对应基因，列对应样本。在矩阵的每个位置，有一个整数值，表示源自样本中特定基因的序列读取总数（如下图）。

count

计数越高表明与该基因相关的读数越多，表明该基因的表达水平越高。然而，这不一定是真的，我们将在本课和课程的后面深入探讨这一点。

2. 数据特征

为了了解 RNA-seq 计数是如何分布的，让我们绘制单个样本 Mov10_oe_1 的计数直方图：

ggplot(data) +
  geom_histogram(aes(x = Mov10_oe_1), stat = "bin", bins = 200) +
  xlab("Raw expression counts") +
  ylab("Number of genes")

histogram

上图展示了一些 RNA-seq count 数据的共有特征：

与大部分基因相关的计数较少
由于没有设置表达上限，因此直方图右方有很长的尾巴
数据的变化范围很大

查看直方图的形状，发现它不是正态分布的。对于 RNA-seq 数据，情况总是如此。此外，正如我们之前观察到的，数据是整数计数而不是连续测量。在决定使用哪种统计模型时，我们需要考虑这些特征。

3. 数据建模

计数数据一般可以用各种分布建模：

二项分布
泊松分布

那么应该选择那一个呢？

在 RNA-seq 数据中，代表了非常多的 RNA，提取出特定转录本的概率非常小。这种情况泊松分布可能是最合适的。然而，这还取决于我们数据中均值和方差之间的关系。

3.1. 均值与方差

为了评估正在处理的数据的特征，可以使用与 Mov10 过表达”对应的三个重复样本。

首先计算样本的均值，再计算方差，最后通过作图的方法，确定它们之间的关系。

# 均值
mean_counts <- apply(data[,6:8], 1, mean)       

# 方差
variance_counts <- apply(data[,6:8], 1, var)

# 构建data.frame
df <- data.frame(mean_counts, variance_counts)

# 可视化
ggplot(df) +
        geom_point(aes(x=mean_counts, y=variance_counts)) + 
        scale_y_log10(limits = c(1,1e9)) +
        scale_x_log10(limits = c(1,1e9)) +
        geom_abline(intercept = 0, slope = 1, color="red")

图应该类似于下面的散点图。每个数据点代表一个基因，红线代表 x = y。

scatterplot

均值不等于方差（数据点的散布不在对角线上）。
对于具有高平均表达的基因，重复之间的方差往往大于平均值（散点在红线上方）。
对于平均表达较低的基因，相当分散。我们通常将其称为“异方差性”。也就是说，对于低范围内的给定表达水平，我们观察到方差值有很多可能性。

4. 重复与差异

生物重复代表对应于同一样本类别或组的多个样本（即来自不同小鼠的 RNA）。直觉上，我们期望来自同一样本组的样本（即在相似条件或扰动下的样本）表现出相似的转录谱。大多数情况下，一个组内的样本会有很高的相似度，但也难免会有很多差异。基因表达的这种差异的来源可以归因于许多因素，其中一些是可知的，而另一些则仍然未知。