哈佛大学——差异表达分析（四）RNA-seq 计数分布

学习目标

1. 探索RNA-seq计数数据的特征
2. 评估RNA-seq计数数据中的均值-方差关系
3. 了解生物学重复的重要性

探索RNA-seq计数数据

计数矩阵（Count matrix）

当我们开始差异基因表达分析时，我们首先得到一个矩阵，该矩阵汇总了数据集中每个样本中的基因水平的表达。矩阵中的行对应于基因，列对应于样本。在矩阵的每个位置，将有一个整数值，该整数值表示源自样本中特定基因的序列读段(reads)总数。

通常来说，计数(counts)越高，表明与该基因相关的读段越多，表明该基因的表达水平越高。但是，这不一定是正确的，我们将在本课程和本课程的后面部分对此进行深入研究。

RNA-seq计数矩阵的特征描述

为了了解RNA-seq计数的分布方式，让我们绘制一个样本“ Mov10_oe_1”的计数直方图：

ggplot(data,aes(Mov10_oe_1))+
  geom_histogram(stat = 'bin', bins = 200)+
  xlab('Raw expression counts')+
  ylab('Number of genes') 

该图说明了RNA-seq计数矩阵的一些常见特征：

• 很小的计数对应有大量的基因
• 由于没有表达上限，右尾较长
• 动态全距大

查看直方图的形状，我们看到它不是正态分布的。对于RNA-seq数据，情况总是如此。而且，正如我们之前观察到的，基础数据是整数计数而不是连续测量。在决定使用哪种统计模型时，我们需要考虑这些特征。

对计数数据进行建模

通常，计数数据可以使用各种分布来建模：

1. 二项分布：可得到在抛硬币多次后获得多个正面的概率。基于离散事件，并在有一定数量案例的情况下使用。因此，它给出了从n个试验中得到r个事件的可能性。
2. 泊松分布：在案例数非常多（即购买彩票的人）但事件发生的可能性很小（获胜的可能性）的情况下使用。泊松类似于二项分布，因为它也基于离散事件，但与来自无限样本的数据一起使用。因此，它给出了在总体中获得r个事件的概率。适用于均值(mean)==方差(variance)的数据。

那么，我们用于RNA-seq计数数据的是什么？
利用RNA-Seq数据，可以表示非常大量的RNA，而提取特定转录本的可能性非常小。这种情况与上述彩票最相似，这表明泊松分布也许是最合适的。但是，这将取决于我们数据中均值和方差之间的关系。

均数 vs 方差

要评估我们正在使用的数据的特征，我们可以使用与“ Mov10 overexpression”相对应的三个重复样本。首先计算平均值的向量，然后计算方差值的向量。然后将这些值相互绘制以评估它们之间的关系。

mean_counts <- apply(data[,6