Nature plants|做完单细胞还可以做哪些下游验证实验

中国科学院分子植物科学中心与南方科技大学在《Nature Plants》期刊上(IF=18.0)发表了关于苜蓿根瘤共生感知和早期反应的文章，该研究首次在单细胞水平解析了结瘤因子处理蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）根系24小时内特异细胞类型的基因表达变化。从样品制备上来讲，除原生质体难制备之外，scRNA-seq的样品要求较高，除了对数目有要求外，对细胞活性也有相关的规定，而snRNA-seq就很好地解决了这个问题。单细胞核转录组测序（snRNA-seq）是对单个的细胞核进行整体测序，和单细胞测序相比，适用对象更广（除新鲜样本外，冰冻样本也可使用）；细胞悬液制备简单，减少酶解、机械压力诱导的假细胞类群产生；在数据分析方面，可以获得内含子区、基因间区的数据，使细胞类型的鉴定分辨率更高，信息更加丰富。

• 期刊：Nature Plants         

• 影响因子：18.0      

• DOI:10.1038/s41477-023-01524-8

• 发表时间：2023.10         

• 样本类型：苜蓿幼苗根系

研究背景

建立豆科植物-根瘤菌共生体系需要时间和细胞类型特异性的精确协调。根瘤菌侵染后，宿主植物的基因表达在最初几个小时内就会发生快速变化，关闭防御并与微生物形成共生关系。本研究基于单细胞转录组学测序技术，探索了结瘤因子处理蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）根系24小时内特异细胞类型的基因表达变化，拓展了对单细胞水平动态时空共生反应的理解。

实验设计

对七日龄幼苗进行NF（结瘤因子）0.5h、6 h和24h处理。为鉴定差异表达基因（DEGs），将模拟对照植株作为三组实验的对照植株，收集根系进行单细胞核转录组文库制备及测序分析。

图 单细胞核转录组学分析示意图

实验结果

1、snRNA-seq揭示了Medicago根的细胞异质性

为了研究早期响应，在7d的M. truncatula幼苗根部接种NFs。并在不同时间点收集根的易感区。作为对照，还收集了接种在缓冲结瘤培养基（BNM）中的根（图 1a）。通过 scVI 整合数据后，确定了 10 个细胞群（图 1b）。这些细胞群合并后，大多数被归类为特定细胞类型，并得到拟南芥根单细胞数据的支持（图1c，d）。此外，还确定了41个特异基因，包括已知的SNF基因（图 1e），成功地揭示了Medicago根的细胞异质性，并对其主要细胞类型进行了分类。

图1单核转录组揭示了苜蓿根系在接种过程中的异质性

2、普遍表达的基因响应模式分析

为了研究早期信号通路中基因的响应模式，将所有细胞簇分为6类基因（图 2a）。其中，第2至第6类基因在所有细胞簇中表达模式相似，但表皮细胞变化更剧烈（图 2b）。细胞簇1 显示出高度异质性的表达模式，表皮细胞集群与其他集群相比具有独特模式（图 2b ）。总之，表皮对NFs诱导的反应更剧烈，0.5hpt时间点与其他时间点不同。

图2  6类主要基因模式随接种时间而变化

3、snRNA-seq揭示了NF诱导的细胞类型特异性反应

研究了每种细胞类型对 NFs 的反应。参与防御、内吞、类黄酮积累和细胞壁重排的途径在 0.5 hpt 内对 NFs 信号做出了快速反应（图 3c-e ）。表皮细胞、皮层细胞和内皮细胞的重编程最为显著，这表明它们在早期反应中起着核心作用。

图 3 单核转录组揭示了 NF 诱导的细胞类型特异性反应

4、表皮细胞亚型对 SNF 至关重要

通过重新聚类，表皮细胞分为1-0和1-1亚细胞群（图 4a）。这两个亚细胞群在所有样本中均存在，表明在加入NFs之前，它们已因差异而分化（图 4b）。亚簇 1-1 中SNF 基因比例明显高于亚簇 1-0，与根瘤菌感染初期相一致（图 4d、e ），表明NFs通过激活AMS信号通路来模拟丛枝菌根共生，因为NFs和Myc-LCOs结构相似。

图4 一种亚型表皮细胞对 SNF 至关重要

5、MtFER和LYK3的共表达

在 0.5 hpt 时提取了表皮和皮层细胞构建共表达网络（图 5a ），进一步探索它们的功能。结果表明，不同亚型在NF诱导的早期反应中功能各异。Turquoise模块在表皮0.5hpt时上调，富集在信号转导和结节通路中，包含许多已知的SNF基因（图 5a,c）。此外，MtFER、PUB1 和 LYK3 的表达水平在 0.5 hpt 达到峰值，随后逐渐下降，这表明它们有潜在的相互作用（图 5d ）。

图 5 单细胞数据揭示了 FER、PUB1 和 LYK3 共享的与结核相关的共表达模块

6、MtFER 的表达模式与 LYK3 相似

研究了LYK3和MtFER在共生反应和结核发育过程中的表达模式，发现它们在同一模块中共表达。pMtFER::GUS和pLYK3::GUS主要在NFs/根瘤菌反应区的表皮细胞、皮层细胞和根瘤中表达，也见于接种或不接种NFs或Sm1021的发育中的根瘤。pMtFER::GUS在根尖高表达，而pLYK3::GUS在该区域弱表达（图6a）。在酵母双杂交和共免疫沉淀实验中，MtFER与LYK3相互作用（图6b、c）。体外激酶试验显示LYK3能使MtFER磷酸化（图6d）。这表明，根瘤菌共生过程中对MtFER的需求可能与它与LYK3的相互作用有关。

图 6 MtFER 被 LYK3 磷酸化

7、根瘤共生需要 MtFER

为了研究根瘤共生是否需要 MtFER，分析了 M. truncatula 突变体数据库中的 MtFER Tnt1 插入突变体（NF4385）。表明 MtFER 在受精和植物生长方面与拟南芥的作用相似。因此，通过表达三种不同RNAi发夹的转化发根，实现了RNA介导的MtFER干扰。RNAi 植物的根生长受到抑制，其根长度只有空载体（EV）对照的 60% 左右（图 7a-c ）。数据表明，敲除 MtFER 的表达会影响根瘤菌表皮感染和根瘤菌在结核内的增殖。

图7 LYK3-MtFER 模块介导的 NFs 信号可能在根瘤菌共生中发挥重要作用

研究结论

本研究通过单细胞转录组学测序技术，对NF处理后的蒺藜苜蓿进行测序。发现表皮和皮质细胞在0.5hpt 时发生基因表达重编程，且大多数变化在6h后恢复。此外，在非分生组织细胞中，植物防御反应基因在0.5h时被激活，随后在6h被抑制。富含共生固氮基因的基因模块表明，MtFER和LYK3对共生信号具有相似的反应。进一步发现MtFER可以被LYK3磷酸化并参与根瘤菌共生。

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参考文献

Liu Z, et al. Single-nucleus transcriptomes reveal spatiotemporal symbiotic perception and early response in Medicago. Nature Plants. 2023