肿瘤微生态研究利器——5R 16S rDNA测序_greengenes2物种注释-CSDN博客

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肿瘤微生物组（Tumor Microbiome）是肿瘤微环境中不可或缺的成员，肿瘤内微生物群通过多种机制影响肿瘤发展，在不同类型的肿瘤中，肿瘤内微生物群的组成和丰度具有高度异质性。由于它们的低生物量和其他障碍，全面描述肿瘤微生物组的特征极具挑战性。目前可用于研究肿瘤内微生物群的技术有荧光原位杂交(FISH)、免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF) 、5R 16S rDNA测序。

5R 16S rDNA高通量测序是对16S rDNA基因上的五个区域（V2、V3、V5、V6、V8）进行多重PCR扩增和测序。可有效降低组织中宿主DNA对细菌16S rDNA扩增的严重干扰。

技术特点

01 灵敏度更高

02 分辨率更高，可用于种水平鉴定

03 适用于微生物含量低的样本，如肿瘤组织，蜡块，血液；

04 有效降低宿主污染

适用样本类型

肿瘤组织，FFPE等低载量生物样本，切片厚度20μm，每样本切片量≥10 张（穿刺样本酌情增加）。

注意事项

（1）样本重复数推荐15个以上。

（2）需要设置空白对照。可有效去除来自样本采集、DNA 提取、PCR 扩增等环节中引入的污染菌。取样建议：例如刮擦ddH2O的棉签；肿瘤组织可以用实验室内部的ddH2O作为阴性对照；棉签擦拭工作台等一切实验端污染来源。

实验及分析流程

5R 16S rDNA

凌恩生物采用SMURF分析流程对测序数据进行分析，采用最大期望算法将多个短扩增区域的序列进行整合分析，找到最有可能的16S序列集合，在使用Greengenes2（August 2023 version）进行注释，直接得到种水平的物种注释结构（species table），再根据阴性对照的结果提出污染菌，最终得到组织中真正存在的菌群，进行下游的分析：α多样性、β多样性、差异分析以及功能预测等。

了解了5R 16S rDNA测序的概念、原理、特点以及送样要求，我们通过2篇文献来看一下它的应用案例吧~

案例1

中文标题：人类肿瘤微生物组由肿瘤类型特异性的细胞内细菌组成

杂志：Science

IF:47.728

本研究对1526个肿瘤及其相邻的正常组织（包括乳腺、肺、卵巢、胰腺、黑色素瘤、骨瘤和脑瘤）进行5R 16S rDNA测序，发现每种肿瘤类型都有独特的微生物组组成，其中乳腺癌的微生物组尤其丰富多样。肿瘤内的细菌大多为胞内细菌，存在于癌细胞和免疫细胞中。研究还注意到，肿瘤内的细菌或其预测的功能与肿瘤类型和亚型、患者吸烟状况以及对免疫疗法的反应存在关联。

图1 在人类肿瘤中检测到细菌成分

图2 乳腺肿瘤的微生物组与其他类肿瘤对比

案例2

中文题目：2022 李斯特菌激发抗肿瘤免疫反应

杂志：Angwandte Chemie International Edition

IF:18.027

本研究通过对小鼠静脉注射PBS、Lmo（单核细胞增生李斯特菌）以及Lmo@RBC（改造后的单核细胞增生李斯特菌）来比较肿瘤免疫治疗效果。通过5R 16S测序对肿瘤组织内的菌群进行检测，结果发现李斯特菌仅出现在Lmo和Lmo@RBC组中。进一步实验发现，Lmo@RBC可诱导细胞焦亡，从而逆转免疫抑制性肿瘤微环境并促进全身性的抗肿瘤免疫反应，对实体瘤和肿瘤转移有极好的治疗效果。

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参考文献

[1]The human tumor microbiome is composed of tumor typespecific intracellular bacteria.Science,2020.

[2]Intravenous Delivery of Living Listeria monocytogenes Elicits GasdmerminDependent Tumor Pyroptosis and Motivates Anti-Tumor Immune Response.ACS Nano,2022.