深入水稻叶际：三代宏基因组测序揭示微生物组新奥秘

在获取叶际微生物宏基因组组装基因组(MAGs)时，研究人员面临着植物宿主污染和测序量限制等高难度挑战。尽管许多老师关注这一领域，但由于污染过高或结果不理想，往往只能采用扩增子技术。凌恩生物在这方面具有深厚的专业知识和技术实力。通过尝试本文介绍的这项新方法，有望克服这些难题，发表高水平的研究成果。

通过HiFi测序，可以为复杂微⽣物群体样本中的单菌组装提供又长又准的序列，⼤幅提升组装效果，打造宏基因组完成图Complete MAGs新概念，并可为复杂微⽣物组的多⽅向研究提供⾼效解决途径。今天，小编带大家看一篇2024年发表于《Communications Biology》的叶际宏基因组的文章。

研究背景

植物微生物组对于植物生长至关重要，但关于植物中特定细菌种类的遗传特性以及这些基因在染色体或质粒上的位置等许多问题仍不清楚。特别是水稻叶片表面（叶际）的微生物群落，对于植物生长和健康具有显著影响。以往的研究方法存在局限性，如培养方法无法涵盖所有微生物，短读长测序难以准确鉴定复杂的基因组。

图1 实验设计和研究方法流程图

主要结果

1、宏基因组解析叶际微生物组的基因组图谱

通过三代宏基因组测序，研究者们共组装得到了26,067个contigs，其中包括142个环状序列。包含了669个完整的16S rRNA基因，这些基因被聚类到166个细菌种，其中121个与已知序列的相似性低于97%，表明它们可能是新种。

表1 组装结果汇总

图2 宏基因组中16S rRNA基因的系统发育概览

粉色圆圈表示宏基因组中每个主要进化树分支检测到的16S rRNA基因数量:带数字的粉色大圆圈表示含有10个以上基因的分支，粉色小圆圈每个代表一个基因。蓝色圆圈表示宏基因组衍生的16S rRNA基因的排名靠前的种/属数。

2、环状序列的分类与功能

三代长读长宏基因组分析的主要优势是有可能获得不可培养微生物的完整基因组序列。环状连续序列中包含了新的细菌染色体和大质粒，以及被定义为新质粒或噬菌体的较小环状连续序列。值得一提的是，研究者们识别出一个未被分离培养的细菌Candidatus Saccharibacteria（RRA8490）的完整染色体。基于16S rRNA基因的系统发育分析表明，其与人类口腔微生物群中发现的分离株成簇。与已报道的菌株的全基因组序列和氨基酸同源性比较分析发现，它们的基因组不同。

图3  预测候选菌门Candidatus Saccharibacteria的潜在新菌株RRA8490的代谢

利用kofamscan、Interproscan和相似性搜索重建代谢途径

3、微生物组的多样性与功能

通过宏基因组数据中获得的16S rRNA分析，研究者们能够更准确地识别水稻叶际中的细菌群落，特别是对于放线菌门(Actinobacteria)的识别。三代宏基因组中放线菌门的相对丰度(28.6%)约为全长16S rRNA扩增子数据集(15.8%)或V4区数据集(15.2%)的两倍。比较放线菌门中属的相对丰度显示，宏基因组中微球菌属的相对丰度约为PCR扩增子测序的2倍。这种差异可能是由于某些类别的放线菌难以使用通用引物检测，即使目标序列相同。

此外，宏基因组基因功能分析显示，甲基杆菌属（Methylobacterium）是水稻叶际中的优势属。

图4 与16S rRNA基因全长扩增子、V4短reads测序和宏基因组中检测到的16S rRNA基因的相对丰度。每种测序方法的细菌门的相对丰度A和放线菌门B的相对丰度。

4、质粒和噬菌体的发现

通过三代宏基因组研究者们还发现了多种质粒和噬菌体，包括携带VirB/VirD4类型四分泌系统（T4SS）的质粒，这在植物-微生物互作中具有重要作用。

图5 宏基因组中发现的T4SS基因的基因排列、预测宿主和估计质粒类型

紫色表示假设的或非T4SS成分基因。

5、MAGs和contigs的物种注释

除142个环状contigs外，利用剩余25,925个contigs分箱，结果将2205个contigs组装成157个MAGs。这些MAGs的基因组大小从274 kbp到9.8 Mbp不等，GC含量从36.4%到75.1%不等，所有的contigs都成功地通过ANI进行了物种注释。在纲水平上，Alphaproteobacteria、Planctomycetes和Actinobacteria占优势，分别占45.2%、25.5%和8.9%。

图6 研究构建的MAGs

每个群落的分类归属由ANI（average nucleotide identity平均核苷酸相似度）确定

完整性(黄色)和污染(橙色)表示

结论与意义

本研究展示了通过三代宏基因组测序，分析植物叶际微生物组成和多样性以及MAGs组装方面的优势。通过这种方法，研究者们能够鉴定完整的细菌MAGs、可移动元件（质粒和噬菌体），并从高质量的连续序列中获得16S基因序列。此外，该研究还揭示了水稻叶际微生物组的复杂性和动态性，而且为未来利用这些微生物组来改善植物健康和生产力提供了可能性。 

参考文献

Masuda, S., Gan, P., Kiguchi, Y. et al. Uncovering microbiomes of the rice phyllosphere using long-read metagenomic sequencing. Commun Biol 7, 357 (2024).