DNA Pull down实验技术介绍

DNA Pull down实验技术介绍

一、技术概述

DNA Pull down 实验是用脱硫生物素标记特异性DNA探针，脱硫生物素探针可以和偶联在磁珠上的链霉亲和素亲和结合。提取物与磁珠-DNA探针孵育，作用蛋白质分子可以和DNA探针特异性结合;经过洗涤可以将非特异性结合蛋白质去除;用Western Blot或质谱对产物进行检测分析。

二、实验目的

DNA pull-down 以感兴趣的DNA序列为探针，寻找与该序列结合的蛋白质，最常见

的应用是寻找某特定基因启动子区域的转录因子。

• 实验流程

• 探针准备

1、PCR扩增目的片段

      表2  PCR反应条件

温度（℃）	时间（s）	循环数
98	10	31
55	5
72	10

表3  PCR反应体系

试剂	使用量(μl)	终浓度
PrimeSTAR Max Premix（2X）	25 μl	1X
Primer F	1μl	0.2 μM
Primer R	1μl	0.2 μM
Template	10ng
灭菌水	Up to 50 μl

全长基因片段的获取，纯化、回收(DNA回收试剂盒，天根：DP214-02 ) ，以全长片段为模板用sense-F/sense-R和AntiSense-F/AntiSense-R引物PCR扩增获

取正义链和反义链的目的基因，跑1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，90V，30min。

2、胶回收

1. 柱平衡：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500µl平衡液BL，        

 12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。

1. 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净EP管中，称取重量。
2. 向胶块中加入等体积的溶液PC，50℃水浴放置10min左右，使胶块充分 溶解。
3.  将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中，12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
4. 向吸附柱中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
5. 重复操作步骤
6. 将吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm离心2min，将吸附柱置于室温，放置3min。8、将吸附柱CB2放入一个新的离心管中，向吸附膜中间位置滴加30μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心1min，收集DNA溶液。

• DNA Pull down 实验

1、样本前处理

1. 收集10^7个细胞至 1.5 mL EP 管内，并用预冷 1×PBS洗涤两次；
2. 用100ul 1×PLB重悬细胞；（预先加入蛋白酶抑制剂）
3. 30%功率超声10次，超2秒，停3秒，时长2min;
4. 4℃翻转孵育30min裂解细胞；
5. 4℃，16000g离心10min；取上清；

2、链霉素亲和磁珠与生物素标记的DNA结合

1. 从4℃冰箱取出链霉亲和素磁珠，震荡混匀后分别取50ul到Probe组及Bead组EP管中；
2. 置于磁力架上静置2min，带磁珠完全吸附到管壁后，移除上清液；
3. 用500ul 2×B&W Buffer 重悬磁珠，置于磁力架上静置2min，带磁珠完全吸附到管壁后，移除上清液；
4. 重复h步骤一次；
5. 加入50ul2×B&W Buffer 重悬磁珠，并加入等体积生物素标记DNA 探针（50pmol）;
6. 室温翻转孵育20min;
7. 置于磁力架上静置2min，带磁珠完全吸附到管壁后，移除上清液；
8. 用100ul预冷的TE buffer重悬磁珠，置于磁力架上静置2min，带磁珠完全吸附到管壁后，移除上清液；
9. 重复m步骤2次（共洗涤3次）；
10. 用100ul预冷的BS/THES buffer重悬磁珠，置于磁力架上静置2min，带磁珠完全吸附到管壁后，移除上清液；
11. 重复o步骤1次
12. 用180ul预冷1×PBS重悬磁珠；

   3、DNA-磁珠复合物与蛋白结合

1. 取10ul e步骤获得的蛋白液标记为input，并于-20℃冻存；
2. 分别取20ul e步骤获得的蛋白液到probe组与Bead组中，并加入2ul蛋白酶抑制剂；
3. 4℃翻转孵育30min;
4. 置于磁力架上静置2min，带磁珠完全吸附到管壁后，移除上清液；
5. 用200ul预冷的BS/THES buffer重悬磁珠，置于磁力架上静置2min，带磁珠完全吸附到管壁后，移除上清液；
6. 重复e步骤4遍（共计洗涤5遍）
7. 加入50ul洗脱液及15ul 5×loadingbuffer,沸水煮10min。

Pull down产物可直接用于后续WB验证或质谱检测；

• 技术优势

✅ 高特异性

✅ 广泛适用性

✅ 高灵敏度

✅ 多维度分析  

• 适用范围

1️⃣ DNA Pull down_WB，用于检测目标DNA序列与某样本中的待测蛋白是否存在相互作用;

2️⃣ DNA Pull down_MS, 用于筛选目标DNA序列与某样本中的哪些蛋白具有相互作用。

六、代表性实验结果