RIP（RNA免疫沉淀）实验技术介绍

RIP（RNA免疫沉淀）实验技术介绍

一、技术概述

RIP（RNA Immunoprecipitation）是一种通过特异性抗体富集与目标蛋白结合的RNA分子的技术，广泛应用于研究RNA与蛋白质的相互作用。本技术利用抗体捕获RNA结合蛋白（RBP）及其结合的RNA，结合高通量测序（RIP-Seq）或qPCR分析，可精准解析RNA-蛋白互作网络，揭示其在基因表达调控、疾病发生及细胞功能中的关键作用。

二、实验目的

本技术主要包括RIP-qPCR和RIP-seq两种;其中RIP-qPCR用来验证与目标蛋

白结合的已知RNA，RIP-seq用来筛选与目标蛋白结合的未知 RNA。

三、实验流程

• 细胞裂解

1.HTR-8冻存细胞解冻后1500rpm，离心1min，去上清。

2.每1x107个细胞加入500µl的RIPA裂解液。

  3.每ml RIPA裂解液加10µl的PMSF以及磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，

再加入10µl的10%SDS和tritonX-100，翻转裂解过夜，-20℃保存。

• 抗体验证：

1. 先配置12%的分离胶，加异丙醇静置20min，待分离胶凝固，吸除异丙醇再用水冲

洗残余的异丙醇，吸水纸吸去残液。加入配置好的5%的浓缩胶，插入梳子，静置20min，待浓缩胶凝固后拔出梳子。

2.安装好电泳装置，上样，先70V,15min，后120V，90min。

3.转膜，湿转120V稳压转100min。

4.封闭，将醋酸纤维膜放入5%的脱脂牛奶中，封闭30min。

5.PBS洗膜3次，每次5min。

6.孵育一抗（1：AGO2,PBS稀释），4℃孵育过夜。

7.PBS洗膜3次，每次10min。

8.孵育二抗（1：1000，PBS稀释），室温孵育2h。

9.PBS洗膜3次，每次10min。

10.按1：1的比例加入试剂盒中的两种发光剂，孵育1min。

11. 把NC膜放到载物台，用化学发光仪进行信号采集。

• 磁珠与抗体结合：

1.标记实验所需的1.5ml EP管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照。

2.吸取50µl重悬后的磁珠悬液于每个1.5ml EP。

3.每管加入500µl RIP Wash Buffer，涡旋震荡。

4.将1.5ml EP管置于磁力架上，并左右转动15º，使磁珠吸附成一条线，去上清，重复一次

  5.用100µl的RIP Wash buffer重悬磁珠，加入约5µg 相应抗体于每个样品中，室

温孵育30min。

  6.将1.5ml EP管置于磁力架上，弃上清。

  7.加入500µl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次。

  8.加入RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上。

• 磁珠抗体复合物与蛋白结合：

  1.将上一步的EP管放磁力架上，去上清，每管加入900µl 表2所示的RIP Immunoprecipitation Buffer。

表2 RIP Immunoprecipitation Buffer配比

RIP Wash Buffer	860µl
0.5M EDTA	35µl
RNase Inhibitor	5µl
Total	900µl

1. 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，14,000rpm，4℃离心10min。吸取

100µl上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml。4℃孵育3h至过夜

1. 孵育完后，短暂离心，将EP管放磁力架上，去上清，加入500µl RIP Wash

Buffer，涡旋震荡后将EP管放磁力架上，去上清，重复5次，总共清洗6次。

（五）RNA洗脱：

1. 用150µl表3所示的Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物，55℃孵育30min。

表3 Proteinase K Buffer配比

RIP Wash Buffer	117µl
10%SDS	15µl
Proteinase K	18µl
Total	150µl

1. 孵育完后，将EP管放磁力架上，将上清吸入一新的1.5ml EP管中，于每管中加入250µl RIP Wash Buffer。

• RNA纯化：

1.  Input样品及sense、antisense、beads 样本分别加入1ml TRIZOL, 颠倒混匀 15 s；

3.  13000 g、4℃离心 10 min，收集上层水相，转移到新无 RNA 酶离心管中；

4.  分别加入 5 µL 糖原（1ug/ul），500 µL 异丙醇充分颠倒混匀；

5.  -80℃过夜沉淀 RNA 样品；

6.  13000 g、4℃离心 10 min，弃上清；

7.  分别加入 1 mL 预冷的 75%乙醇，10000 g、4℃离心 5min，弃上清，室温静置风干 10min；

8.  加入15ul DEPC处理水，溶解RNA。

• RNA反转录：

1.  按照下列组分配制RT反应液（反应液制备请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性，减少分装造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。

试剂组分	使用量	终浓度
5×PrimeScript Buffer（for Real Time）	2uL	1×
PrimeScript RT Enzyme Mix I	0.5uL
Random 6 mers（100 μM）*1	0.5uL	50 pmol
RNA	7 uL

2.  按如下程序进行反转录：

37℃,15min；85℃，5sec；-20℃保存备用！

3． 定量PCR检测

1） 将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。

2） 冰上配制下表中的反应液

成分	加入量	终浓度
Hieff qPCR SYBR® Green Master Mix (low Rox)	5μL	1×
Forward Primer (10μM)	0.2μL	0.2 μM
Reverse Primer (10μM)	0.2μL	0.2 μM
cDNA（diluted 1:5）	2μL
RNase-free Water	to 10μL

3）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

4）采用三步法程序进行反应：

循环数	步骤	温度	时间	荧光采集
1	预变性	95℃	5min	No
40	变性	95℃	10s	No
	退火	60℃	30s	Yes
上述反应结束后，从60℃～95℃过程中进行熔解曲线分析

• 技术优势

✅ 高特异性：经验证抗体确保靶标蛋白的高效富集

✅ 兼容性强：支持多种RNA类型（mRNA、lncRNA、miRNA）

 ✅ 低背景干扰：严格洗涤步骤及对照设计（IgG、Input）确保数据可靠性

• 适用范围

1️⃣ RNA结合蛋白研究

2️⃣ 非编码RNA功能

3️⃣ 疾病机制探索（癌症、神经疾病中异常RNA-蛋白互作的分子基础）

4️⃣ 药物靶点筛选

六、代表性实验结果