图位克隆法

基因的图位克隆
图位克隆(Map-based cloning)又称定位克隆(positional cloning)，1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，使用 与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行逼近目的基因或通过染色体登陆的方法最终 找到包含该目的基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列。

 

图位克隆的特点是无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息，但应有以下两方面的基本情况。一是有一个根据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体，如F2、DH、BC、RI等。二是开展以下几项工作：
1)首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记；
2)用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置；
3)构建含有大插入片段的基因组文库(BAC或YAC库)；
4)以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库；
5)用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群；
6)通过染色体步行、登陆或跳跃获得台有目标基因的大片段克隆；
7)通过亚克隆获得带有目的基因的小片段克隆；
8)通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列，步骤见图4-10。下面将对其中几个关键环节予以叙述。

 

 

1  图位克隆的技术环节

1.1  构建遗传作图群体

 

用于作图群体的类型可有多种。一般说来，在这类群体中，异花授粉植物分子标记的检出率较自花授粉植物的高。但是对于基因的图位克隆而言，培育特殊的 遗传群体是筛选与目标基因紧密连锁的分子标记的关键环节。这些遗传材料应该满足这样的条件，即除了目标基因所在座位的局部区城外，基因组DNA序列的其余 部分都是相同的，在这样的材料间找到的多态性标记才可能与目标基因紧密连锁。

 

目标基因的近等基因系(NILs)是符合条件的一类群体。近等基因系是指几乎仅在目标性状上存在差异的两种基因型个体，这可通过连续回交的途径获 得。由于NILs的遗传组成特点，一般凡是能在近等基因系间揭示多态性的分子标记就极有可能位于目标基因的两翼附近。Martin等(1993)就是用 RAPD技术分析番茄PTO基因的近等基因系而获得了与该基因表现共分离的分子标记，以该分子标记为探针筛选基因组文库而实现了染色体登陆。又如在玉米 上，利用AFLP技术分析玉米CMS-S型雄性不育的恢复基因及近等基因系，已获得与目标基因紧密连锁的分子标记并以其用作分离RF3基因的探针。

 

一般说来，当标记为显性遗传时，欲获得最大遗传信息量的F2群体，须借助于进一步的子代测验，以分辨F2中的杂合体。为此，Michelmore等 (1991)发明了分离群体分组分析法(bulked segregant analysis，BSA)以筛选目标基因所在局部区域的分子标记。其原理是将目标基因的F2(或BC1)代分离体的各个体仅以目标基因所控制的性状按双 亲的表型分为两群，每一群中的各个体DNA等量混合，形成两个DNA混合池(如抗病和感病、不育和可育)。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个 DNA混合池之间理论上主要在目标基因所在局部区域的差异，这非常类似于NILs，故也称作近等基因池法。研究表明，近等基因系法、分离群体分组分析法再 结合AFLP等强有力的分子标记技术使人们能够在短时间内从数量众多的分子标记中筛选出与目标基因紧密连锁的标记。更为有意义的是，这种策略在尚未构建遗 传图谱的物种中也是可行的。

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