基因工程-3-基因工程载体

在大肠杆菌中使用的大多数质粒载体都带有一个来源于 pMB1质粒或ColEl质粒的复制子结构，其复制方式见图3.3。在复制时，首先合成前引物RNAⅡ，它会与 DNA形成杂交体。而后RNase H切割前RNA Ⅱ，使之成为成熟的RNA Ⅱ，并形成三叶草型二级结构，引导质粒的复制。另一个片段 RNA I可控制RNA Ⅱ形成二级结构,而调控序列Rop具有增强RNA I的作用，从而控制质粒的拷贝数。削弱RNA Ⅰ和 RNAⅡ之间相互作用的突变，将增加带有pMB1 或ColEl复制子的拷贝数。

（2）质粒的拷贝数

质粒可分为：严谨型质粒（1~10个）和松弛型质粒（多达几百个）。

pBR322质粒的复制子来自pMB1质粒，是严谨型复制子。pUC系列质粒的复制子则来自pMB1突变的复制子，其拷贝数较高，是松弛型质粒。

（3）质粒的不相容性

两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称为质粒的不相容性(incompatibility)，它是指在第二个质粒导人后，在不涉及DNA限制系统时出现的现象。

不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。有相同复制起始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中，其分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的:两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中--种质粒。而不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，- -般具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现30多个不相容群，如ColE1(或pMB1)、pSC101和p15A分别是不同的不相容群中的质粒。

（4）可转移性

质粒具有可转移性，能在细菌之间转移。转移性质粒能通过接合作用从-一个细胞转移到
另一个细胞中。

质粒的这种移动特性，与质粒本身有关，也取决于宿主菌的基因型。具有转
移性的质粒带有一套与转移有关的基因，它需要移动基因mob、转移基因tra、顺式作用元件bom以及内部转移缺口nic。

3.1.1.2质粒载体必须具备的条件

基因工程质粒是指在染色体外能够独立复制和稳定遗传的一类克隆载体和表达载体。

质粒越大，作为克隆载体的效率就越低。

具备条件：

拷贝数较高。便于实现目的基因的大量复制和扩增。
分子量较小。一般来说，低分子量的质粒通常拷贝数比较高，这不仅有利于质粒DNA的制备，同时还会使细胞中的克隆基因的数量增加，分子量更小更容易分离纯化，转化。
具有筛选标记。质粒的抗性基因是常用的筛选标记，例如氨苄青霉素抗体（Amp^r)、卡那霉素抗体（Kan^r）、四环素抗体（Tet^r）等

β-半乳糖苷酶筛选系统也是一个常用的非常方便的筛选系统。

质粒上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的lacZ'基因，编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段(a片段)。利用诱导剂IPTG (异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)可以诱导该蛋白片段的合成，这个片段能与宿主细胞所编码的β-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段(LacZOM15)进行a互补。在培养基中有IPTG诱导物时，细菌含有编码lacZ'基因的质粒，同时含有LacZ0M15，就能合成β-半乳糖苷酶的氨基端和羧基端的两种片段，从而在有生色底物X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的培养基上形成蓝色菌落。lacZ'基因的中间带有一一个多克隆位点，但MCS并不破坏lacZ ' 基因编码产生的a片段。当外源基因插入多克隆位点后会使lacZ'基因失活，不能表达产生β-半乳糖苷酶的氨基端片段从而破坏a互补作用。因此，目的基因重组质粒的菌落是白色的。利用这种筛选方法可以方便地将含有目的基因的重组子筛选出来(见图3.4)。

具有较多的限制酶切位点，目前大多数都有MCS，较多的单一限制性核酸内切酶酶切位点对外源基因的DNA片段插入提供便利。

具有复制起始位点，可以使繁殖后的宿主细胞维持一定数量的质粒拷贝。但穿梭质粒有两个复制子，一个是元和复制子，一个是真核复制子，既能够在原核细胞中扩增和增殖，又能够在真核细胞中扩增和增殖。这种能够在两种或两种以上的不同细胞内进行复制和扩增的载体，叫做穿梭载体（shuttle vector）。

3.1.1.3常用的克隆质粒

（1）pBR322

环状双链DNA分子，含有两个抗药性基因（四环素抗性基因tet^r和氨苄青霉素抗性基因amp^r），一个复制起始位点和多个用于克隆的限制酶切位点。

一般只选择一个抗生素基因的酶切位点作为插入外源DNA之用，外源DNA插入之后改抗生素抗性失效，另一种抗生素抗性基因作为转化细菌后筛选阳性克隆只用。

但目前基因工程克隆中，常用的克隆质粒载体是pUC系列和pGEM系列的质粒。

（2）pUC18/19

pUC18/19包括以下几个部分：

来自pBR322质粒的复制起始位点（ori）；
氨苄青霉素抗性基因（amp^r），优化，不再含有基因内原有的限制酶切位点；
大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ) 的启动子(Plac)、操作子(lacO)及其编码β-半乳糖苷酶氨基端a-肽链的lacZ'基因；
多克隆位点(MCS)，位于lacZ'基因内部靠近5'端的地方，内含13 种限制性内切酶的位点(见图3.5)，使含有不同黏端的目的DNA片段可方便地定向插入载体中，并不破坏lacZ'基因的功能。

与pBR322相比具有优点：

一是质粒具有更小的分子量和更高的拷贝数，仅保留了氨苄青霉素抗性基因和复制起点。只有2686kb；
二是pUC18质粒结构中增加了lacZ' 基因，编码的ar 肽链可与宿主细胞内的LacZOM15产生的片段进行ar 互补。可用X-gal显色法进一-步对重组子克隆进行鉴定，从而使重组子检测更方便可靠。
三是增加了多克隆位点(MCS)。 pUC18 质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点(MCS)，可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。因此，克隆到MCS当中的外源DNA片段，可以方便地从pUC18质粒载体转移到M13mp8载体上，进行克隆序列的核苷酸测序工作。同时，也正是由于具有MCS序列，可以使具两种不同黏性末端的外源基因直接克隆到pUC18质粒载体上。

(3) pMD18-T 载体

pMD18-T载体是在pUC质粒基础上改建过来的载体，是专门用来克隆PCR扩增产物的。

pMD18 含有与pUC18质粒相同的复制起点，以及amp'和lacZ'标记基因，只是多克隆位点上增加了EcoRV的酶切位点。pMD18质粒经过EcoRV酶切线性化，再在线性末端加上一个T碱基，就得到了线性化的pMD18-T载体。因为用Taq酶做PCR扩增的DNA末端都自动延伸带有一个凸出的A末端，T载体的T末端正好与A末端互补，从而将PCR产物直接克隆到T载体上(图3.8)。

T载体是目前各个实验室应用最广泛、最常用的一个质粒克隆载体。

(4) pCR- Blunt 克隆载体
pCR- Blunt克隆载体是一种用于提高克隆平末端片段效率的载体。

该载体最大的特点是在lacZ'基因的下游融合了一个ccdB基因，它对大肠杆菌是致死的。pCR-Blunt 的大小为3.5kb，含有卡那霉素抗性基因(kan') 和新霉素抗性基因(zeo5) (图3.10)。

在克隆平末端外源片段时，先将载体切成线状，再与目的基因连接，然后转化大肠杆菌细胞。如果载体发生自连，因为ccdB基因的存在，获得这些载体的大肠杆菌宿主细胞将会死亡。只有当外源DNA片段与载体连接后，ccdB基因的表达受到抑制，含有重组质粒的大肠杆菌便存活下来。这样获得平末端阳性克隆的重组效率可达80%以上。

另一个平末端克隆载体是pPCR-ScriptAmpSK(十)克隆载体。

该载体从pBluescripIISK(+)噬菌粒改造而来，只是将多克隆位点中的Xba I和Spe I位点改成Srf I位点(5'-GCCC/GGGC-3')。克隆DNA片段时，先将载体用Srf I切成线状，再与目的DNA片段混合做连接反应。在连接体系中除了添加T, DNA连接酶外，还加入Srf I酶。

在这个反应体系中，当载体发生自连后，Srf I酶又会将其切开，载体就处于酶切与连接的动态平衡中。只有当载体与目的DNA片段连接后，酶学反应才能稳定下来，从而将总体的反应平衡向载体与目的DNA片段连接这个方向倾斜。

这样的连接反应混合物表现出很高的连接效率，在转化大肠杆菌后通过a-互补筛选出现80%以上的白色菌落，其中90%以上是阳性克隆子。

(5) pGEM条列体外转录载体

GEM质粒系列是与pUC系列十分类似的小分子载体。总长度为2743bp，含有一个氨卡青霉素抗性编码基因(amp') 和一个lacZ' 编码基因。在后者还插人了一段几乎与UC18克隆载体完全一样的多克隆位点。

pGEM系列与pUC系列之间的主要差别是，它具有两个来自噬菌体的启动子，即T启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着提供寺异性识别位点(图3.11)。由于这两个启动子分别位于lacZ' 基因中多克隆位点区的两则，若在反应体系中加入纯化的T,或SP6 RNA聚合酶，便可以将已经克隆的外源基因在体外转录出相应的mRNA。

质粒载体pGEM-3Z和pGEM-4Z在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于SP6和T,这两个启动子的位置互换、方向相反而已。