seurat使用笔记（数据处理、PCA、聚类）

一、数据前处理

#保持好习惯，先清空一下环境，设置保存路径
rm(list = ls())
setwd("")

1.数据读取

载入包

#载入程辑包
#multtest包安装tips,
#install.packages("BioManager")
#BiocManager::install("multtest"),
##如果出现显示R版本不符的error不要着急换R版本，直接打开R软件选择就近的镜像安装。
library(multtest)
library(Seurat)
library(dplyr)
library(patchwork)
library(R.utils)

导入数据

 CreateSeuratObject用于创建Seurat对象

pbmc.data <- Read10X(data.dir = "hg19")
#Load the PBMC dataset,创建Seurat对象，counts为读取的源文件，project为Seurat对象想保存的文件名，
#可以加上限定条件：min.cells为组织中分离的最少细胞数，min.features为一个细胞中测出的最少的基因数量
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)
#查看pbmc中细胞数量的3个方法
pbmc
## An object of class Seurat 
## 13714 features across 2700 samples within 1 assay ,细胞数量是2700个
## Active assay: RNA (13714 features, 0 variable features)
ncol(pbmc)
## [1] 2700
ncol(pbmc.data)

2.进行质控

我们提到单细胞数据质控的时候，⼀般是指细胞的过滤，其实是从⼀个barcode X gene矩阵中过滤掉⼀部分不是细胞的barcode，如细胞碎⽚，双细胞，死细胞等。这三类barcode的特征可以通过其对应的基因表达情况来描述：nCount(总基因表达数)、nFeature(总基因数)、
percent.HB(红细胞基因表达⽐例)、percent.MT(线粒体基因表达⽐例)。nCount和nFeature过⾼可能是双细胞，过低可能是细胞碎⽚。percent.HB刻画红细胞⽐例，percent.MT刻画细胞状态，值过⾼可能是濒临死亡的细胞

PercentageFeatureSet 函数是根据counts总数相除算的打分：该基因集的counts总和/所有基因的counts总和。

    基因集占的百分比 = 分子 / 分母 * 100；
分子：  指定基因的 counts种总和，在这次分析中是指细胞的线粒体基因转录本数

分母： 从 meta.data 获取 nCount_RNA 列，就是每个cell中所有基因的 counts总和

这个函数的意思是，每个细胞的线粒体的基因数/细胞总基因数的百分比，将作为一列数据加到pbmc的metadata中，这一列的列名为“percent.mt"

#进行质控，计算每个细胞的线粒体基因转录本数的百分比（%），使用[[ ]] 操作符存放到metadata中；
#分析的时候要确认好物种，如果是小鼠的，要用mt
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-") 
#在创建对象 CreateSeuratObject() 的过程中，会自动计算细胞中独特基因与总基因数目，可以在目标对象中找到
head(pbmc@meta.data,5)

                 orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA percent.mt
AAACATACAACCAC-1     pbmc3k       2419          779  3.0177759
AAACATTGAGCTAC-1     pbmc3k       4903         1352  3.7935958
AAACATTGATCAGC-1     pbmc3k       3147         1129  0.8897363
AAACCGTGCTTCCG-1     pbmc3k       2639          960  1.7430845
AAACCGTGTATGCG-1     pbmc3k        980          521  1.2244898

3.质控结果的可视化

目的:通过可视化质控结果，进一步去掉低质量的数据

（1）小提琴图，将pbmc中的meta@data中的3个指标成图

#(1)将QC结果展示为小提琴图，features中的名称加引号，ncol=3表示图形分三列展示
VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)