单细胞测序数据整合

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已于 2022-06-16 22:35:32 修改

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文章标签： r语言数据分析

于 2022-06-16 22:33:55 首次发布

本文链接：https://blog.csdn.net/G2530051386/article/details/125312733

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一、单细胞测序数据整合的原理

单细胞测序数据的整合，有点类似于基因组的拼接和比对过程。整合过程需要找到两个dataset之间的相似的部分，在单细胞测序数据则意味着两个两次不同实验的dataset中有一部分细胞具有相似的生物学状态（虽然这簇细胞的基因表达绝对值不一定相同，但是这簇细胞整体具有一致性或相似性）。

A 两个来自不同实验的单细胞数据，有相似生物学状态的细胞群，但是query dataset具有特有的细胞群

B 进行常规的相关性分析，并进行Log2标准化处理。

C 在同一个共享空间下，鉴定两个dataset之间相互最近的邻居(MNN)，这些cells就可以作为两个dataset之间的anchors细胞，从而帮助进行dataset 整合。

D 对于每一个anchor对，会给予一致性给出打分值

E 基于这些anchors细胞以及打分值，计算矫正向量，从而进行数据集的整合

来源：单细胞测序数据整合 - 知乎 (zhihu.com)https://zhuanlan.zhihu.com/p/158974557?ivk_sa=1024320u

二、一般步骤

来源：单细胞数据整合 Comprehensive Integration - 知乎 (zhihu.com)https://zhuanlan.zhihu.com/p/465227964

（1）Normalization

在所有的分析中，我们都要对 single-cell RNA-seq数据集采用标准的预处理。除非特别声明，我们首先对所有的数据集进行 log-normalization, lognormalization 的目的是防止数据差异完全被高度表达的基因控制，在log-normalization 后，它就会与基因表达水平独立，使得表达水平较低的基因不易被忽视

之后，我们再做 z-score transformation, 它是进行降维操作如PCA之前的一个标准步骤。z-scroe transformation 的目的见下图，由于技术的原因，不同细胞检测到的转录水平是不一样的，即数据有noise, 进过 transfrom之后，不同细胞之间的数据才有可比性。

（2）Feature selection for individual datasets

在每个数据集中，我们接下来要进行特征选择，选择出一组特征（e.g. 基因），使得它们在不同的细胞间展现出高度的变化，可以首先用于下游分析。

对每个基因，我们计算它在所有细胞中的标准值的方差，我们直接使用这个方差对特征排序，选取2000个有最大标准方差的基因作为“高变基因”。这一过程可以用Seurat v3中的FindVariableFeatures 函数实现。

(3) Feature selection for integrated analysis of multiple datasets

在整合所有数据集的时候，我们要给高变基因优先权。因此，我们首先单独对每个数据集特征选择，使用上面说的流程。然后看每个基因在所有的数据集中单独被认定为高变基因的个数，用这个指标来作排序，选取top 2000的基因用作下游分析。这些步骤可以用Seurat v3中的函数 SelectIntegrationFeatures 来实现。

(4)Identification of anchor correspondences between two datasets

整合分析的关键步骤是找出两个数据集的锚点（anchors)。锚点代表两个细胞（每个数据集各一个细胞），它们是相关性最大的一对来自不同数据集的细胞，我们预测它们来自一个共同的生物状态。因此找到了锚点，我们就能判断不同数据集间的细胞关系，从而有利于后续的整合操作。 Anchors for reference assembly or transfer learning 的计算可以分别使用Seurat v3包中的函数 FindIntegrationAnchors 和 FindTransferAnchors 。

三、代码实现

方法一：Seurat v3的标准整合流程

（1）数据获取

#清空环境，养成好习惯
rm(list = ls())
setwd("")
library(Seurat)
library(multtest)
library(dplyr)
library(ggplot2)
library(patchwork)
library(SeuratData)#涵盖函数InstallData和LoadData
library(tidyverse)

测试数据选择Seurat提供的ifnb数据集，其中包含两个PBMC样品，一个为干扰素刺激处理，另一个为对照。

#install.packages('devtools')

library(devtools)
devtools::install_github('satijalab/seurat-data',force = TRUE)
InstallData("ifnb")
LoadData("ifnb")

将ifnb根据stim状态拆分为两个list (stim and CTRL),其中包含两个PBMC样品，一个为干扰素刺激处理，另一个为对照

ifnb.list <- SplitObject(ifnb, split.by = "stim")
C57 <- ifnb.list$CTRL
AS1 <- ifnb.list$STIM

（2）数据处理

分别进行数据标准化＋选择高变基因

myfunction1 <- function(testA.seu){
  testA.seu <- NormalizeData(testA.seu, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
  testA.seu <- FindVariableFeatures(testA.seu, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
  return(testA.seu)
}
C57 <- myfunction1(C57)
AS1 <- myfunction1(AS1)

Integration ----FindIntegrationAnchors用来寻找样本整合的数据点（anchors）

testAB.anchors <- FindIntegrationAnchors(object.list = list(C57,AS1), dims = 1:20)
testAB.integrated <- IntegrateData(anchorset = testAB.anchors, dims = 1:20)

需要注意的是：上面的整合步骤相对于harmony整合方法，对于较大的数据集（几万个细胞）非常消耗内存和时间，大约9G的数据32G的内存就已经无法运行；当存在某一个Seurat对象细胞数很少（印象中200以下这样子），会报错，这时建议用harmony整合方法

（3）数据分析及可视化

1.切换到整合后的assay，设置为integrated可以理解为：这是整合后的数据。您可以将其看作批处理调整的数据。接下来的分析将基于这种整合数据

DfaultAssay(testAB.integrated) <- "integrated"

# # Run the standard workflow for visualization and clustering
testAB.integrated <- ScaleData(testAB.integrated, features = rownames(testAB.integrated))
testAB.integrated <- RunPCA(testAB.integrated, npcs = 50, verbose = FALSE)
testAB.integrated <- FindNeighbors(testAB.integrated, dims = 1:30)
testAB.integrated <- FindClusters(testAB.integrated, resolution = 0.5)
testAB.integrated <- RunUMAP(testAB.integrated, dims = 1:30)
testAB.integrated <- RunTSNE(testAB.integrated, dims = 1:30)
p1<- DimPlot(testAB.integrated,label = T,split.by = 'stim')#integrated

# Visualization
p2 <- DimPlot(immune.combined, reduction = "umap", group.by = "stim")
p3 <- DimPlot(immune.combined, reduction = "umap", label = TRUE, repel = TRUE)

2.将DefaultAssay设置为“RNA”，意味着接下来的分析将基于原始值,进行识别保守细胞类型标记,可以使用整合的数据进行聚类。但是对差异基因使用integrated是不合适的，而且大多数工具只接受原始的DE计数。

DefaultAssay(testAB.integrated) <- "RNA"
testAB.integrated <- ScaleData(testAB.integrated, features = rownames(testAB.integrated))
testAB.integrated <- RunPCA(testAB.integrated, npcs = 50, verbose = FALSE)
testAB.integrated <- FindNeighbors(testAB.integrated, dims = 1:30)
testAB.integrated <- FindClusters(testAB.integrated, resolution = 0.5)
testAB.integrated <- RunUMAP(testAB.integrated, dims = 1:30)
testAB.integrated <- RunTSNE(testAB.integrated, dims = 1:30)
p4 <- DimPlot(testAB.integrated,label = T,split.by = 'stim')
p1|p4

可以看到以原始值为分析对象的话，会出现批次效应，两个样本几乎没有重叠的细胞群，Integration方法可以去除批次效应，这些方法首先识别处于匹配生物学状态（anchors）的跨数据集细胞对，然后基于这些anchors校正数据集之间的批次效应。测试样品经过批次矫正后，相同类型的细胞都聚到了一起，这样更有利于对细胞类型进行鉴定。

方法二、harmony的方法

主要优点是：速度快，内存小

基本原理：我们用不同颜色表示不同数据集，用形状表示不同的细胞类型。首先，Harmony应用主成分分析将转录组表达谱嵌入到低维空间中，然后应用迭代过程去除数据集特有的影响。

（A）Harmony概率性地将细胞分配给cluster，从而使每个cluster内数据集的多样性最大化。（B）Harmony计算每个cluster的所有数据集的全局中心，以及特定数据集的中心。

（C）在每个cluster中，Harmony基于中心为每个数据集计算校正因子。

（D）最后，Harmony使用基于C的特定于细胞的因子校正每个细胞。由于Harmony使用软聚类，因此可以通过多个因子的线性组合对其A中进行的软聚类分配进行线性校正，来修正每个单细胞。重复步骤A到D，直到收敛为止。聚类分配和数据集之间的依赖性随着每一轮的减少而减小。

来源：“harmony”整合不同平台的单细胞数据之旅 - 云+社区 - 腾讯云 (tencent.com)https://cloud.tencent.com/developer/article/1650648

1.数据处理

在运行Harmony之前，创建一个Seurat对象并按照标准PCA进行分析，流程同第一个方法

if(!require(harmony))devtools::install_github("immunogenomics/harmony")
test.seu <- pbmc
test.seu <-  test.seu%>%
  Seurat::NormalizeData() %>%
  FindVariableFeatures(selection.method = "vst", nfeatures = 2000) %>% 
  ScaleData()
test.seu <- RunPCA(test.seu, npcs = 50, verbose = FALSE)

2.Run Harmony

运行Harmony的最简单方法是传递Seurat对象并指定要集成的变量。RunHarmony返回Seurat对象，并使用更正后的Harmony坐标。让我们将plot_convergence设置为TRUE，这样我们就可以确保Harmony目标函数在每一轮中都变得更好。

#####先运⾏Seurat标准流程到PCA这⼀步，然后就是Harmony整合，可以简单把这⼀步理解为⼀种新的降维########
test.seu=test.seu %>% RunHarmony("stim", plot_convergence = TRUE)
#设置reduction = 'harmony'，后续分析就会调用Harmony矫正之后的PCA降维数据。
test.seu <- test.seu %>% 
  RunUMAP(reduction = "harmony", dims = 1:30) %>% 
  FindNeighbors(reduction = "harmony", dims = 1:30) %>% 
  FindClusters(resolution = 0.5) %>% 
  identity()

test.seu <- test.seu %>% 
  RunTSNE(reduction = "harmony", dims = 1:30)

3.可视化

#按照合并的分组进行tsne作图，group.by = "stim"
p5 <- DimPlot(test.seu, reduction = "tsne", group.by = "stim", pt.size=0.5)+theme(
  axis.line = element_blank(),
  axis.ticks = element_blank(),axis.text = element_blank()
)
#根据细胞类型进行tsne作图，group.by = "ident"
p6 <- DimPlot(test.seu, reduction = "tsne", group.by = "ident",   pt.size=0.5, label = TRUE,repel = TRUE)+theme(
  axis.line = element_blank(),
  axis.ticks = element_blank(),axis.text = element_blank()
)