5生物化学与分子生物学——蛋白质的共价结构

5生物化学与分子生物学——蛋白质的共价结构

蛋白质通论

蛋白质的元素组成与分类

蛋白质主要元素组成：C、H、O、N、S及P、Fe、Cu、Zn、Mo、I、Se等元素

• • • • • 元素含量最多的是C，其次是S（氨基酸中只有半胱氨酸Cys和甲硫氨酸Met含有S）

• • • • • 但无论由什么途径取得的蛋白质，平均含N量始终为16%，这是由凯氏（Kajedahl）定氮法测定蛋白质含量的理论依据

• • • • • 所谓定氮法就是将蛋白质消化掉，所有有机氮转变为无机氮，从而测定蛋白质含氮量，然后根据含氮量反推含蛋白质量 蛋白质含量 = 蛋白质含N量 x 6.25

• • • • • • 碳氢氧都不是蛋白质的特有元素，只有N才能排除多糖之类的物质的干扰

• • • • • • 蛋白质换算系数最早是由 Mulder 在1839年提出的，他把几种蛋白质高度纯化处理后，发现它们都有一个共同的分子式 C40H62N10O12，通过这个分子式，可以计算出其中的氮占蛋白质分子的16%，因此，氮的蛋白质的换算比例为6.25

• • • • • • 1除以6.25正好等于 16%

• • • • • • 但需要注意的是不同蛋白质的精确折算系数是不一样的（R基团的存在）

蛋白质分类

• • • • • 根据分子形状分类

• • • • • • 球状蛋白质

• • • • • • • 球状蛋白质，一类蛋白质，其多肽链所盘绕的立体结构为不同程度的球状分子，多肽链是通过链内的次级键，如氢键、盐键、二硫键、疏水作用和范德华力来维系其空间结构的。球状蛋白质有多种多样的生物功能，它溶于水且溶于稀的中性盐溶液中，如中性盐浓度过高，即从溶液中析出.这种现象称为盐析。加热也能使之沉淀或凝固.血清球蛋白、乳球蛋白等均属球状蛋白质

• • • • • • 纤维状蛋白质

• • • • • • • 纤维状蛋白外形呈纤维状或细棒状，分子是有规则的线性结构。纤维状蛋白可分为不溶性蛋白和可溶性蛋白，不溶性蛋白包括：角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白等；可溶性蛋白包括肌球蛋白和血纤维蛋白原

• • • • • 根据组成成分分类

• • • • • • 简单蛋白质

• • • • • • 结合蛋白质

• • • • • 根据功能分类

• • • • • • 非活性蛋白质（如硬蛋白、角蛋白等组成结构类蛋白质）

• • • • • • 活性蛋白质（如酶蛋白、转运蛋白、运动蛋白、保护和防御蛋白、受体蛋白等）

蛋白质分子形状和大小

纤维状蛋白：多数不溶于水和稀盐酸，少数如肌球蛋白成串连接后可溶

球状蛋白：可溶

膜蛋白：不溶于水（特别是在细胞膜内测一些区域富含疏水性的氨基酸），可溶于去污剂（Triton 100、去氧胆酸钠）

蛋白质相对分子质量变化很大，一般在6000 - 1x10^6（一般认为生物体内最小的蛋白质分子为胰岛素：6733，比胰岛素还要小的肽类称为多肽）

蛋白质结构和功能的多样性

蛋白质序列的多样性决定了其功能的多样性

蛋白质的主要功能

• • • • • 催化：大多数酶是蛋白质

• • • • • 调节：如激素和反式作用因子

• • • • • • 反式作用因子是转录模板上游基因编码的一类蛋白调节因子，包括激活因子和阻遏因子等，它们与顺式作用元件中的上游激活序列特异性结合，对真核生物基因的转录分别起促进和阻遏作用

• • • • • 转运：如血红蛋白、载脂蛋白、膜转运蛋白等

• • • • • 贮存：如种子蛋白和卵清蛋白

• • • • • 运动：如肌肉、微管蛋白等

• • • • • 结构成分：如角蛋白、胶原蛋白等

• • • • • 支架作用：如锚定蛋白、连接蛋白等

• • • • • • 如细胞信号转导过程中，细胞间相互识别的位点的蛋白质即含有支架蛋白

• • • • • 防御和进攻：如抗体、毒蛋白等

• • • • • 特殊功能：如甜蛋白、胶质蛋白等

肽

肽和肽键的结构

肽（peptide）是氨基酸的线性聚合物，因此也称肽键（peptide chain）

蛋白质的二级结构中最主要的共价键是肽键（peptide bond） 有的时候二硫键也参与这样的功能

• • • • • 最简单的肽为二肽（dipeptide），含有一个肽键

• • • • • 一般把不多于12个残基的肽叫二肽、三肽……十二肽

• • • • • 不多于20个残基的肽叫寡肽（oligoteptide）

• • • • • 多于20个残基的肽叫多肽

• • • • • 在多肽中的AA称为氨基酸残基（amino acid residue）

肽基的C、O和N原子间的共振相互作用

• • • • • 从理论上讲，肽链形成的肽键都是单键，但实际上，由于形成肽键中的酰胺上有一个孤电子对，此孤电子对离域后于羰基碳的轨道之间有重叠，通过此重叠，氮和羰基碳的氧之间形成了共振相互作用，最终在肽键间形成了共振杂化体的结构

• • • • • 产生键的平均化（键长：1.33 nm。介于1.25 - 1.45 nm之间）

• • • • • 形成酰胺平面或肽基平面（amide / peptide plane）

• • • • • 限制绕肽键的自由旋转

• • • • • 肽键呈反式构型

肽的物理和化学性质

肽的晶体熔点高，说明是离子晶格

肽至少有一个游离的氨基和游离的羧基，也是两性化合物，至少有2级解离，通常都有多级解离。因此，肽在水溶液中能够带电，也有自己的等电点pI，其计算与测定氨基酸等电点相同

• • • • • 找其兼性离子带静电荷为零时左右两端基团的解离常数的对数的平均值，即为其等电点

肽游离的α-氨基、α-羧基、R基团的化学反应与氨基酸类似

• • • • • 双缩脲（两个尿素分子缩合而成）反应：（双缩脲相似于三肽，即两个肽键），与碱性硫酸铜溶液反应，生成紫红色化合物

• • • • • 用于鉴别是否有蛋白质存在（凡大于三肽的肽都能发生此反应，2肽不行）

几种有生理活性的多肽（谷胱甘肽*）

• • • • • 注意谷氨酸与半胱氨酸的肽键是由谷氨酸的 γ 羧基与半胱氨酸的 α 氨基缩合而成（考过）

• • • • • 谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，或保护巯基酶。或防止过氧化物积累

• • • • • • 脑啡肽具有阵痛的作用（吗啡，癌症晚期病人扎针扎杜冷丁即吗啡；中医针灸的原理也可能是针扎在穴位上后刺激大脑产生脑啡肽参与疼痛抑制）

蛋白质（多肽）一级结构的测定

基本策略

片段重叠法 + 氨基酸顺序直测法

基本步骤

首先是得到蛋白质的纯品（95%以上）

测定蛋白质分子中多肽链数目

• • • • • 首先弄清楚蛋白质中有多少个亚基（测定蛋白质相对分子量，然后通过测定它氨基端或羧基端摩尔数与其相对分子量的比值）

拆分蛋白质的多肽链，断开多肽链内二硫键

• • • • • 加入去污剂断开非共价键，加还原剂断开二硫键（二硫苏糖醇）

分析每一条多肽链的氨基酸组成

• • • • • 氨基酸分析仪

鉴定多肽链N - 末端、C - 末端氨基酸残基

• • • • • 把蛋白质打成小片段、一段一段分析，分析完再重叠

• • • • • 链内二硫键的位置是一个很重要一级结构信息

多肽N、C-末端氨基酸的测定

N端

• • • • • Sanger法（二硝基氟苯反应）

• • • • • • 最后通过气相色谱分析标记肽，得到氨基末端的氨基酸的数据

• • • • • DNS法（丹磺酰氯反应）

• • • • • • 丹磺酰氯具有很强的荧光特性，所以其反应出来的氨基酸都可以用荧光检测仪来检测，灵敏度比Sanger法强100倍，适用于微量蛋白质测序

• • • • • Edman法（苯异硫氰酸酯反应）

• • • • • • Edman法各个步骤自动化就形成了蛋白质测序仪（最关键试剂：苯异硫氰酸酯PITC）

• • • • • 氨肽酶（amino peptidase）法

• • • • • • 从N端开始一个个水解肽键。常用的亮氨酸氨肽酶（Leu amino peptidase）

• • • • • 测定氨基酸时所用反应*通用于多肽

C端（N端被其它化合物结合，被封闭） 如：焦谷氨酰环化、乙酰化。焦谷氨酸氨肽酶处理再自动分析仪分析

• • • • • 肼解法

• • • • • • 水相中所剩余的就是C端氨基酸，再根据氨基酸分析方法分析即可

• • • • • 羧肽酶法（由于酶切割氨基酸下来后，氨基酸解离的时间不好确定，这种方法与氨肽酶一样很少使用）（不同的羧肽酶切割氨基酸的能力不一样）

• • • • • • 羧肽酶A：Arg精氨酸-碱性、Lys赖氨酸-碱性、Pro脯氨酸除外的氨基酸残基（碱性氨基酸除了精氨酸和赖氨酸外还有组氨酸）

• • • • • • 羧肽酶B：仅Arg、Lys

• • • • • • 羧肽酶C：除羟脯氨酸外的所有氨基酸残基

• • • • • • 羧肽酶Y：所有的氨基酸残基

• • • • • 还原法

分开链内链间氨基酸

二硫桥的断裂

彻底酸水解

双向纸层析

拆分多肽链

酶裂解法（与氨肽酶、羧肽酶一样，酶切位点是考试重点）

• • • • • 胰蛋白酶：专一性切割由Arg或者Lys提供羧基缩合形成的肽键位点（一般蛋白质精氨酸和赖氨酸分布都比较均匀，其分割出来的多肽也比较合适，再加上胰蛋白酶的专一性，使其成为最常用的一种蛋白酶）

• • • • • 胰凝乳蛋白酶：相对专一切割由Phe、Tyr、Trp等疏水AA的羧基缩合形成的肽键

• • • • • 胃蛋白酶：切割的肽键两边的氨基酸是疏水氨基酸即可

• • • • • 弹性蛋白酶：切割脂肪族氨基酸的羧基形成的肽键

化学裂解

• • • • • 这样的化合物只切割由甲硫氨酸形成的羧基肽键位点（在实际应用中切出的片段可能过大）

生物质谱仪

蛋白质组学研究的基础（自行查阅资料）