10生物化学与分子生物学——酶促反应动力学

10生物化学与分子生物学——酶促反应动力学

概念

是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学

底物浓度对酶促反应速度的影响

酶与底物的中间络合物学说

在低浓度时，反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征

随底物浓度增加，反应速度不再呈正比例增加，表现为混合级反应

当底物浓度达到一定值，反应速度达到最大值，此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应

据此现象，Henri提出假说：当酶催化某一化学反应时，酶首先和底物结合生成中间复合物（ES），然后生成产物（P），并释放出酶

酶和底物结合生成中间复合物（ES）已被电子显微镜和X射线晶体结构分析仪直接观察到

1903年，Henri用蔗糖酶水解蔗糖的实验，实验得到的双曲线显示酶促反应的速度变化可以分成三个阶段

酶促反应的动力学方程式

1913年前后，Michaelis和Menten在前人工作的基础上，假定酶和其与底物的中间络合物快速建立平衡，底物浓度远远大于酶浓度，ES分解产物的逆反应忽略不计

进而推导出下列方程

鉴于酶促反应效率高，ES形成后迅速成为产物并释放酶，即K2远小于K-1，快速平衡不一定成立。在Michaelis和Menten动力学基础上，1925年Briggs和Haldane提出酶反应分两步进行，即“稳态”理论（steady state）

• • • • • 第一步：酶与底物形成复合物

• • • • • 第二步：ES复合物释放酶和产物

• • • • • 推导过程见书

• • • • • Km的物理意义是：米氏常数是当酶反应速率达到最大反应速率的一半时的底物浓度。因此，Km的单位为 mol/L

动力学参数的意义

• • • • • Km是酶的一个特征性常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关（Km值是在酶的最适条件下测量出来的）

• • • • • Km值可以判断酶的专一性和天然底物

• • • • • 若已知某个酶的Km值，可以计算在某一个底物浓度时，反应速率相当于最大反应速率Vmax的百分率

• • • • • • 如当[S]=3Km时，根据米氏方程（从中也可以看出当无限增加底物浓度来提高反应速率时永远达不到最大反应速度）

• • • • • Km不等于Ks。在K3远小于K1、K2时，Km看作Ks，也只有此时1/Km才可以近似表示酶与底物结合的难易程度（1/Km越大，酶与底物越容易结合，催化的反应越快，即Km越大，酶与底物结合越不容易）

• • • • • Km可以帮助推断某一反应的方向和途径

• • • • • • 判断可逆反应方向的效率，了解其主要催化方向

• • • • • • • 以上图为例：当Km越小时，酶与底物结合越容易——此可逆反应中，应该是肌酸结合酶生成磷酸肌酸更多

• • • • • • 可推断连锁反应的限速步骤

• • • • • • • 如图，本连锁反应的限速步骤是第一步（Km值最大）

• • • • • • 可推断多酶体系中的优势途径

• • • • • • • 如图，本体系中丙酮酸主要走第一条途径

• • • • • Vmax和K3（Kcat）的意义

• • • • • • 在一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一个常数。同一种酶对不同底物的Vmax也不同，pH、温度和离子强度等因素也影响Vmax的数值

• • • • • • 当底物浓度很大时，Vmax=K3 [E] 成线性关系，而直线的斜率为K3，为一级反应速率常数，它表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，此常数又叫做转换数（简称TN），又称为催化常数（catalytic constant，Kcat）。Kcat值越大，表示酶的催化效率越高

利用作图法测定Km和Vmax

• • • • • 直接用双曲线来测定的话，无论如何也求不出Vmax的值，所以需要转换一下求解思路

• • • • • 基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km

• • • • • 双倒数作图法（Lineweaver-Burk）

• • • • • • 缺点：实验点会过分集中在直线的左下方（特别是底物浓度低的时候），而低浓度S因其倒数后误差大会影响Km和Vmax的准确测定

• • • • • Eadie-Hofstee法

• • • • • Hanes-Woolf作图法

• • • • • • 将双倒数作图法的式子两边乘以 [S] ，则米氏方程改写为

• • • • • Eisenthal和Cornish-Bowden直接线性作图

• • • • • • 此方法相对来说求出的值更加精准

关于米氏方程的具体推导见教材

双底物的酶促反应动力学

按动力学机制可分为两大类

• • • • • 序列反应（单-置换反应）（sequential reactions）

• • • • • • 特征

• • • • • • • 底物的结合和产物的释放有一定的顺序，产物不能在底物完全结合前释放。A和B两底物均结合到酶上，然后反应产生两产物P和Q

• • • • • • 分类

• • • • • • • 有序反应（orderd reactions）

• • • • • • • • 底物按照一定的顺序与酶结合（A领先底物），形成三元复合物，然后按照一定的顺序释放反应的产物

• • • • • • • • 这样反应的话就存在领先底物和最后释放出来产物之间与酶结合的竞争情况

• • • • • • • • 以乙醇脱氢酶为例

• • • • • • • 随机反应（random reactions）

• • • • • • • • 两底物随机地与酶结合，形成三元复合物，产物的释放也是随机的

• • • • • • • • 以肌酸激酶为例

• • • • • 乒乓反应（双-置换反应）（ping pong reactions）

• • • • • • 酶与领先底物A的反应产物（P）在酶与第二个底物B反应之前释放出来，结果酶E转变为一种修饰酶形式E'，然后再与底物B反应生成第二个产物Q，同时释放出未被修饰的酶E

• • • • • • 以谷氨酸：天冬氨酸氨基转移酶为例（氨基转移酶基本都属于这类作用机制）

酶的抑制作用

定义

由于酶必须基团化学性质的改变，使酶的活性降低或丧失，但并不引起酶蛋白变性的作用称为抑制作用（inhibition）

能够引起抑制作用的化合物称为抑制剂（inhibitor）

抑制程度的表示方法

相对活力分数（残余活力分数）

相对活力百分数（残余活力百分数）

抑制分数：指被抑制而失去活力的分数

抑制百分数

抑制作用的类型

不可逆抑制作用（irreversible inhibition）

• • • • • 定义：抑制剂与酶蛋白中的必需基团以共价键形式结合，引起酶的永久性失活，不能用透析或超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性

可逆抑制作用（reversible inhibition）

• • • • • 定义：抑制剂与酶蛋白以非共价键方式结合，引起酶活性降低或暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性

• • • • • 竞争性抑制（competitive inhibition）

• • • • • • 某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竞争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了

• • • • • • 竞争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除

• • • • • • 例子：丙二酸和戊二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂

• • • • • 非竞争性抑制（noncompetitive inhibition）

• • • • • • 酶可同时与底物及抑制剂结合，即底物和抑制剂没有竞争作用。酶与抑制剂结合后，还可以与底物结合；酶与底物结合后，也可再结合抑制剂，但是三元的中间产物不能进一步分解为产物，所以酶活性降低

• • • • • • 如某些金属离子（铜离子、银离子、汞离子、铅离子等）通常能与酶分子的调控部位中的-SH（半胱氨酸）基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制；EDTA结合金属离子引起的抑制作用也属于非竞争性抑制（所以在避免抽提核酸蛋白质的时候，我们会在抽提溶液中假如EDTA，与溶液中的金属离子螯合，防止酶被抑制）

• • • • • 反竞争性抑制（uncompetitive inhibition）

• • • • • • 酶只有与底物结合后才与抑制剂结合，从而导致酶活性下降。常见于多底物反应

• • • • • • 例如：L-Phe对碱性磷酸酯酶的抑制作用

可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别

物理方法

• • • • • 用透析、超滤或凝胶过滤等物理方法区别（不可逆抑制是共价键结合酶）

动力学方法

• • • • • 在测定酶活力的系统中假如一定量的某种抑制剂，然后测定不同酶浓度的反应初速度

• • • • • 在测定酶活力的系统中加入不同浓度的抑制剂，然后测定不同酶浓度的反应初速度

可逆竞争作用动力学

竞争性抑制

• • • • • 加入竞争性抑制剂后，Km值变大，Vmax不变

非竞争性抑制

• • • • • 加入非竞争性抑制剂后，Km值不变而，而Vmax变小

反竞争性抑制

• • • • • 加入反竞争性抑制剂后，Km和Vmax均减少

不同类型可逆抑制作用的米氏方程和常数

一些重要的抑制剂

不可逆抑制剂

• • • • • 非专一性不可逆抑制剂：作用于酶的一类或几类基团（包括必需基团），引起酶的失活

• • • • • • 有机磷化合物—与酶活性直接有关的丝氨酸上的-OH牢固地结合，从而抑制某些蛋白酶或酯酶。（DFP、敌百虫、敌敌畏、农药1605等）

• • • • • • • 这类化合物又叫神经毒剂

• • • • • • • 可用解磷定（碘化醛肟甲基吡啶）或氯磷定（氯化醛肟甲基吡啶）解毒

• • • • • • 有机汞、有机砷化合物：与酶蛋白上的-SH作用，从而抑制含-SH酶的活性。这类抑制作用可加入过量的巯基化合物（如半胱氨酸或还原型谷胱甘肽GSH）解除

• • • • • • • 对氯汞苯甲酸

• • • • • • • 有机砷化合物如：路易斯毒气（lewisite）（氯乙烯氯砷）

• • • • • • 重金属盐：银离子、铜离子、汞离子、铅离子、铁离子等在高浓度时能使大多数酶失活，低浓度时起抑制作用，加入金属螯合剂EDTA（乙二胺四乙酸，或者其钠盐—EDTA本身溶解度较低）、半胱氨酸等可以解除

• • • • • • 烷化剂：如碘乙酸、碘乙酰胺、2，4-二硝基氟苯等能使酶蛋白中的-SH、-NH2、-OH、-COOH、咪唑基等发生烷基化，使酶失活

• • • • • • 氰化物、硫化物、CO: 与含铁卟啉的酶中的Fe3+结合，使酶失活