8生物化学与分子生物学——蛋白质的分离、纯化和表征

8生物化学与分子生物学——蛋白质的分离、纯化和表征

蛋白质的酸碱性质

定义

蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是具有两性解离性质的化合物

各种解离基团的解离度与溶液的pH有关，pH越低，碱性解离度越大，蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升高，则解离情况相反

蛋白质本身的电荷是所有残基和侧链基团电荷的总和，而侧链基团与成AA时的电荷数不同是因为蛋白质环境下其结构发生了变化导致的

等电点（pl）

在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正电荷相等，静电荷为零，这一pH称为该蛋白质的等电点（pl）

蛋白质的等电点与组成蛋白质的酸性氨基酸与碱性氨基酸的数量以及这两者之间的比值有关，一般情况下，蛋白质中酸性氨基酸比例越高，它的等电点越偏酸

等离子点（isoionic point）

• • • • • 等电pH并不是一个恒定的值，它会因溶液中盐的种类和离子强度的影响而有所不同（当溶液中的盐解离成正负离子时，其与蛋白质的酸性或碱性侧链基团或AA发生结合即影响等电点pH）

• • • • • 等离子点是指蛋白质在纯水溶液没有其他离子干扰下的带点状态，完全由H+的解离和结合来决定，这种条件下的等电点称为等离子点。等离子点是蛋白质的特征性常数

蛋白质的分子大小与分子量的测定

蛋白质的分子量范围：6X10^3~1X10^6 Da

根据化学组成测定最低相对分子量

定义

• • • • • 用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子，则可由此计算出蛋白质的最低分子量

例如肌红蛋白和血红蛋白的Fe含量均为0.335%，可计算二者的相对分子质量（得到的最低相对分子量就是肌红蛋白的分子量，而血红蛋白的相对分子量需要乘以4）

也可以利用蛋白质中含量极少的AA，用同样的原理计算蛋白质的最低分子量

渗透压法测定相对分子量

渗透压法测定Mr操作简单，Mr在10-100kDa时较准， 但当蛋白质样品不纯、含有其他种类蛋白质时，渗透压法不能测准

沉降分析测定Mr

沉降速度法：在强大的离心场中，如果蛋白质溶液的密度大于溶液密度，溶液中的蛋白质会发生沉降，根据沉降的速度来计算蛋白质的相对分子质量

沉降速度取决于蛋白质的分子量、分子密度、分子形状和溶剂的密度、粘度

沉降系数（S20,W）：单位离心场强度时的沉降速度。定义1S=10^-13秒（斯维德贝格单位）

S：沉降系数 D：扩散系数 ρ：溶剂的密度 v：蛋白质的偏微分比容（所谓偏微分，意思就是当测量影响某一个物质性质时通过两个互不干扰的因素中改变一个，另外一个不变，最后观察物质性质的变化）

沉降平衡法

将纯的分析样品放于离心机中，在较低速度（8000-10000 rpm）长时间离心（24hr），蛋白质分子颗粒沉降形成浓度差，而扩散又使样品颗粒由高浓度向低浓度区扩散，最终达到沉降与扩散的平衡状态（目前少用）

凝胶过滤法

凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离，同时可以测定蛋白质分子量。测定蛋白质Mr一般采用交联葡聚糖-Sephadex（不同交联度对应不同分子量大小的蛋白质）

蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关：先测得几种标准蛋白质Ve（Ve为洗脱体积），并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品得Ve，查标准曲线即可确定分子量

目前此方法在蛋白质结构测定中常常用于蛋白质的分离提纯

SDS-PAGE法测定Mr

SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

具有较高分辨率。用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关

分辨率非常高，适合蛋白质的分离

当电泳体系中含有一定浓度的SDS时，电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量

• • • • • SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小

例子

胶体性质与蛋白质的沉淀

蛋白质胶体溶液的稳定性

蛋白质颗粒大小属于胶体例子的范围（1-100nm）。又由于其分子表面有许多极性基团，亲水性极强（表面包裹一层水化层），易溶于水成为稳定的亲水胶体溶液

• • • • • 小于1称为溶液象，大于100称为悬浊液

蛋白质保存常常在某一盐的溶液中

蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素：双电层（蛋白质表面常常带有一样的电荷，此电荷层吸引反电荷从而形成双电层）；水化层

胶体性质

• • • • • 丁达尔效应

• • • • • 布朗运动

• • • • • 不能透过半透膜

蛋白质的沉淀

定义

• • • • • 蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假若改变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮结沉淀现象，这既是所谓的蛋白质沉淀作用

盐析法 （salting out）

• • • • • 中性盐（NH4SO4-较温和，NaSO4，NaCl等）→蛋白质脱去水化层（盐具有很高的溶解度）

• • • • • 优点：不引起蛋白质变性

• • • • • 盐溶（salting in）：稀盐溶液中蛋白质溶解度增加的现象（适当盐浓度增加蛋白质溶解度，此时若增加或减少盐浓度蛋白质均会析出）

• • • • • • 在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大，这种现象称为盐溶

有机溶剂沉淀法

• • • • • 极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）→脱去水化层以及降低介电常数而增加带点质点间的相互作用

• • • • • • 极性有机溶剂与水的结合能力非常强，能脱去蛋白质的水化层

• • • • • • 甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂可以提供自己的羟基或羰基上的氢或氧去形成氢键，从而破坏了蛋白质中原有的氢键，使蛋白质变性（即蛋白质分子中的次级键被破坏。主要是氢键和离子键），但特殊操作条件下可仅仅使蛋白质各种分子间相互作用力的减弱以及蛋白质的unfold，使蛋白质的介电常数的降低，引起蛋白质分子相互聚集而沉淀而不使蛋白质变性

• • • • • 条件：低温操作，缩短时间（浓缩蛋白质时用低温丙酮操作）

重金属盐沉淀法

• • • • • 当溶液pH＞pI，蛋白质颗粒带负电，易于与重金属离子结合（汞离子、铅离子、铜离子、银离子等）→生成沉淀

生物碱试剂和某些酸类沉淀法

• • • • • 生物碱试剂—能引起生物碱沉淀的一类试剂。当溶液pH＜pI时，蛋白质颗粒带正电荷→易与生物碱试剂酸根负离子反应→沉淀

• • • • • 用途：临床出去体液中干扰测定的蛋白质（糖尿病测尿糖之前加生物碱）

加热变性沉淀法

• • • • • 原理：加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，损坏了水化层

• • • • • 用途：制豆腐（加热+少量盐卤）

蛋白质的变性与复性

定义

在某些物理或化学因素作用下，天然蛋白质严密的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失（酶失去催化活力，激素丧失活性），则称之为蛋白质变性作用（denaturation）——变性与沉淀是两个概念

有些蛋白质的变性是可逆的，通过适当的方法（如透析）将变性剂除去后，蛋白质可以恢复其天然立体结构，这个过程称为复性（renaturation）

一般认为蛋白质变性本质是次级键的破坏，只有空间构象的改变，并不涉及一级结构（共价键）的变化

变性因素

化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂、尿素等

物理因素：加热、射线（紫外线，白内障的病因就是眼球内部由于长期紫外线照射导致的眼球蛋白变性）、超声波、剧烈震荡等

变性后蛋白质的表现

旋光值改变

特性粘度增加

• • • • • 特性黏度（intrinsic viscosity）是指高分子溶液粘度的最常用的表示方法。 定义为当高分子溶液浓度趋于零时的比浓粘度。 即表示单个分子对溶液粘度的贡献，是反映高分子特性的粘度，其值不随浓度而变。 常以 [η]表示，常用的单位是分升/克 (dL/g)

溶解度降低

扩散系数降低

结晶能力丧失

易于沉淀，加热还会凝固。但若远离等电点则不一定沉淀

• • • • • 当蛋白质远离等电点时，变性蛋白之间靠负电荷互相排斥而不聚集沉淀

变性后蛋白质肽键暴露而更加易于消化

变性蛋白质为什么能复性

在一定环境条件下，蛋白质的一级结构能够决定二、三、四级结构。变性蛋白质的二、三、四级结构虽然遭到破坏，但是一级结构仍然保持不变，因此除去变性剂后在适当的环境条件下，蛋白质能卷曲折叠成为能量最低的构象，一般天然蛋白质正是具有这种能量最低的构象

如 胃蛋白酶 加热至80～90℃时，失去溶解性，也无消化蛋白质的能力，如将温度再降低到37℃，则又可恢复溶解性和消化蛋白质的能力

蛋白质分离纯化的一般原则

方法一览

根据分子量：如沉降速度法离心

根据密度：沉降平衡法离心

根据电荷和分子量：聚丙烯酰胺凝胶电泳

根据分子量和分子形状：凝胶过滤

根据溶解度：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀

根据电荷：等电点沉淀

根据分子大小不同的分离纯化方法

透析：利用半透膜的选择通透性来纯化蛋白质这样的大分子物质的过程叫透析

超过滤：是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质分子被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的，有时要用切向流过滤法

• • • • • 切向流过滤（TFF）是一种样品在压力的驱动下，根据过滤膜孔径大小进行物质分离的一种膜过滤过程。 在这个过程中，样品会切向通过膜的表面，小于膜孔径的小分子和缓冲液会透过膜，大于膜孔径的分子会被截留参与下一次循环过滤。 样品流速和滤膜方向平行，而透过滤液的流速和滤膜方向垂直

• • • • • 目前实验室常用方法：纯化完后还可通过冷冻干燥的方法进一步纯化得到蛋白质结晶

凝胶过滤法：凝胶过滤（层析）是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之为分子筛层析或排阻层析

• • • • • 凝胶颗粒内部是多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子直接从凝胶间隙流过，最先被洗脱出来；而小于孔径的分子进入凝胶颗粒内，路程较前者更加曲折，最后被洗脱出来

• • • • • 而蛋白质的紫外线最高吸收峰是280nm，这样随着检测仪器检测到的波长，不同种类的蛋白质因此而分离

利用溶解度差别的纯化方法

影响蛋白质溶解度的外部因素很多，其中主要有溶液的pH、离子强度、介电常数和温度。溶解度归根结底取决于他们本身的分子结构

等电点沉淀技术

• • • • • 在等电点pH条件下，蛋白质为电中性，其物理性质如导电性、溶解度、黏度、渗透压等都表现为最低值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性质常被用于蛋白质的分离制备，被称为等电点沉淀技术

• • • • • 在等电点时,蛋白质分子以两性离子形式存在,其分子净电荷为零(即正负电荷相等),此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥,分子相互之间的作用力减弱,其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀,所以蛋白质在等电点时,其溶解度最小,最易形成沉淀物，重组

• • • • • 这种使蛋白质分子之间产生相互作用的作用力主要是长程作用力（短程作用力很难克服分子的布朗运动）

盐析

• • • • • 当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析

• • • • • • 离子在溶液中具有饱和浓度，即某一确定温度和压强下离子存在于某种溶剂中的浓度存在上限值，当离子浓度恰达到该值时，产生该种离子的电解质恰巧达到沉淀—溶解平衡。当离子浓度超出饱和浓度时即可形成该离子的过饱和溶液，此时溶解体系十分不稳定，外部环境的轻微扰动即可导致离子晶体不断析出，直至溶液中所含离子的浓度降低至饱和浓度为止

有机溶剂分级分离法

• • • • • 引起蛋白质沉淀的主要原因是改变了介质的介电常数

• • • • • 温度对蛋白质溶解度的影响：0-40℃之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加

• • • • • 具体内容见前文

根据电荷不同的纯化方法

电泳：在外电场作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳（本质上是综合利用分子量和电荷的差别进行分离）

按电泳的原理分类

• • • • • 自由界面电泳

• • • • • • 移动界面电泳是不含支持物的电泳。溶质在自由溶液中泳动，故也称自由电泳，适用于高分子的检测，但不易完全分离

• • • • • 区带电泳

• • • • • • 区带电泳是含有支持物的电泳，支持物上混合样品被置于狭小的区带中泳动，分离出彼此分离的区带。支持物有很多种，由此又衍生出区带电泳的不同分支，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳、纸电泳、等电聚焦电泳、等速电泳、薄层电泳等

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

• • • • • 三种物理效应：样品的浓缩效应、分子筛效应和电荷效应

• • • • • 聚丙烯酰胺实际上是由单体-丙烯酰胺和甲叉由不同比例和总的浓度配制而成，通过调节其比例和浓度，我们可调节形成的凝胶的网眼的大小（丙烯酰胺是一种神经毒性的物质，易挥发，在体内容易累积，当聚合形成凝胶时，其毒性消失，配置时不小心滴在手上应立刻用水冲洗干净）

• • • • • 一般采用非连续性电泳，下面浅绿色的为分离胶（蛋白质分子很小，调高其浓度，蛋白质分子量大时调低其浓度），上面一段为浓缩胶

• • • • • • 浓缩胶的作用是有 堆积作用 ，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带

• • • • • 这种电泳分离方法只是以蛋白质分子量大小进行分离，但当分离蛋白需求上升时，比如分离同样分子量-不同等电点的蛋白质时，就需要用到双向电泳分离

• • • • • • 第一步采用等电聚焦方法，采用柱状凝胶，根据不同蛋白质等电点的差异把蛋白质分开

• • • • • • 第二步采用PAGE分离出同样等电点不同分子量的蛋白质

• • • • • • 第三步用质谱技术分辨出目的蛋白质

• • • • • • 是10年前大规模蛋白质鉴定常用的方法

离子交换层析

• • • • • 此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法

• • • • • 若选择阳离子交换树脂，则溶液中的其他阳离子能跟其解离出的H+发生交换而结合在树脂上

• • • • • 若选择阴离子交换树脂，则溶液中的其他阴离子能跟其解离出的OH-发生交换而结合在树脂上

• • • • • 物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的

亲和层析

定义

• • • • • 利用化学方法将待分离物质可逆特异性结合的化合物连接在某种固相载体上，再将固相载体装柱

• • • • • 当待提纯物质通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异性结合而留在柱子上，杂质便被冲洗出去。再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到提纯目的

受配体分类

• • • • • 抗原和抗体

• • • • • 激素和受体蛋白

• • • • • 凝集素和糖蛋白

虽然这种方法简便有效，但存在一定局限性：不能纯化实验室自己设计的蛋白质，需要提纯的蛋白质有丰富的配体结合位点。目前有很多商用试剂盒，满足了商品化蛋白质生成的需求

蛋白质的含量测定与纯度

蛋白质的含量测定

测定蛋白质的量是研究蛋白质最基本的一步

• • • • • 最早的经典方法是凯氏定氮法（蛋白质氮元素含量16%，此法需要蛋白质无杂质，且转变成无机氮，方法较繁琐，目前已弃用）；稍后应用较广泛的方法是双缩脲法、福林-酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝法

双缩脲法

• • • • • 基于蛋白质分子中的肽键，凡是两个肽键以上的多肽物质均会发生双缩脲反应

• • • • • 在碱性溶液中蛋白质可以与铜离子反应形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关

福林-酚法（Lowry法）

• • • • • 福林-酚法主要基于蛋白质在碱性溶液中能与铜形成复合物，此复合物以及芳香族氨基酸残基可以还原酚试剂而产生蓝色，再与标准蛋白质（牛血清蛋白质—前所述双缩脲法也使用此标准蛋白质）比色定量

• • • • • 此方法灵敏度高，但是如果样品与标准蛋白质的芳香族氨基酸差异较大时，会有较大的系统误差

• • • • • 试剂甲的成分与双缩脲法一致，试剂乙的配置非常困难且试剂多具有毒性，现在已经不再使用此方法

紫外线吸收法

• • • • • 蛋白质组成中常含有酪氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm处有最大吸收峰，故可用280nm波长的光吸收光密度的大小来测定一般蛋白质的含量

• • • • • 但当蛋白质的纯度不够时，这种方法测得的含量可能会不准确（各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要准确定量，必需要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较）

考马斯亮蓝法（Bradford法）

• • • • • 考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈现红色，与蛋白质结合则呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定

• • • • • 本法试剂配制简单，操作简便，是一种常见的蛋白质快速微量测定方法（1ug）

蛋白质纯度鉴定

电泳

沉淀

HPLC

N末端测序……