MicrobiomeAnalyst 文件配置及使用

MicrobiomeAnalyst是一个方便易用的网页工具，是系统全面分析微生物组学数据的分析网站。

https://www.microbiomeanalyst.ca

所需的Data文件如下图所示。

 一、公司文件(以美吉为例)

1.OTU/ASV table(Taxonomy labels included)

文件位置：workflow_results\ASVTaxon_summary\asv_taxon.xls

将ASV ID一列删除；将taxonomy一列移动到最前面(需要删除其中k__norank_d__Bacteria分类等级，将d__Bacteria改为k__Bacteria)；将taxonomy改为#NAME

修改后

 

 2.Metadata file

 自行编辑

 

 3.(Optional) phylogenetic tree

文件位置：workflow_results\ASV\ASV_phylo.tre

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 二、QIIME 2生成的文件

1.所需原始文件：

1.1 seq(样本序列)：扩增子测序文件(gz格式或者fastq和fasta格式)

 1.2 manifest(样本列表)：第一列为样本的ID，第二列为每个样本测序文件的路径。

1.3 metadata.txt(Meta信息)：第一列为样本的ID，其他列为meta信息(例如分组)

 1.4 分类器(classifier)

# 训练分类器

# 下载GreenGenes并解压
wget http://greengenes.microbio.me/greengenes_release/gg_13_5/gg_13_8_otus.tar.gz
tar -xzvf gg_13_8_otus.tar.gz

# 导入参考序列
qiime tools import \
--type 'FeatureData[Sequence]' \
--input-path gg_13_8_otus/rep_set/99_otus.fasta \
--output-path 99_otus.qza

# 导入物种分类信息
qiime tools import \
--type 'FeatureData[Taxonomy]' \
--input-format HeaderlessTSVTaxonomyFormat \
--input-path gg_13_8_otus/taxonomy/99_otu_taxonomy.txt \
--output-path ref-taxonomy.qza

# 提取特定区段序列(引物序列可自行修改，此处为799F-1193R)
time qiime feature-classifier extract-reads \
--i-sequences 99_otus.qza \
--p-f-primer AACMGGATTAGATACCCKG \
--p-r-primer ACGTCATCCCCACCTTCC \
--o-reads ref-seqs_G_799F-1193R.qza

# 生成特定分类器
time qiime feature-classifier fit-classifier-naive-bayes \
--i-reference-reads ref-seqs_G_799F-1193R.qza \
--i-reference-taxonomy ref-taxonomy.qza \
--o-classifier classifier_G_799F-1193R.qza

2.QIIME 2处理：

2.1 文件生成

Quality Score中位数至少大于20，结果显示序列不用剪切。

# 创建data文件夹
mkdir data_MicrobiomeAnalyst
 
# 数据导入(质量值33类型的单端数据)
time qiime tools import \
--type 'SampleData[SequencesWithQuality]' \
--input-format SingleEndFastqManifestPhred33V2 \
--input-path manifest \
--output-path demux.qza

# 结果可视化(用于DADA2参数调整)
# Quality Score中位数至少大于20
time qiime demux summarize \
--i-data demux.qza \
--o-visualization demux.qzv

# 生成特征表和代表序列(DADA2降噪)
# n-threads：线程数，0为使用全部线程
# trim-left：序列剪切起点，0为不剪切
# trunc-len：序列剪切终点，0为不剪切
time qiime dada2 denoise-single \
--i-demultiplexed-seqs demux.qza \
--p-n-threads 0 \
--p-trim-left 0 \
--p-trunc-len 0 \
--o-representative-sequences rep-seqs.qza \
--o-table table.qza \
--o-denoising-stats stats.qza
 
cp table.qza data_MicrobiomeAnalyst/
 
# 生成进化树
qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree \
--i-sequences rep-seqs.qza \
--o-alignment aligned-rep-seqs.qza \
--o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza \
--o-tree unrooted-tree.qza \
--o-rooted-tree rooted-tree.qza
 
cp rooted-tree.qza data_MicrobiomeAnalyst/
 
# 生成物种注释文件
qiime feature-classifier classify-sklearn \
--i-classifier /mnt/e/bioinfo/storage/QIIME2/classifier/database/classifier_G_799F-1193R.qza \
--i-reads rep-seqs.qza \
--o-classification taxonomy.qza
 
cp taxonomy.qza data_MicrobiomeAnalyst/

2.2 文件处理

# 进入data文件夹
cd data_MicrobiomeAnalyst

# 1.OTU/ASV table
# table.qza → table.rar → feature-table.biom
biom convert -i feature-table.biom -o table.txt --to-tsv
# feature-table.biom → table.txt

# 2.Metadata file
# 自行编辑

# 3.Taxonomy table
# taxonomy.qza → taxonomy.rar → taxonomy.tsv

# 4.(Optional) phylogenetic tree
# rooted-tree.qza → rooted-tree.rar → tree.nwk

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 三、QIIME2处理公司文件

文件位置：

workflow_results\ASV\ASV_table.qza

workflow_results\ASV\ASV_reps.qza

# 创建data文件夹
mkdir data_MicrobiomeAnalyst

# 放入数据
cp ASV_table.qza data_MicrobiomeAnalyst/

# 生成进化树
qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree \
--i-sequences ASV_reps.qza \
--o-alignment aligned-rep-seqs.qza \
--o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza \
--o-tree unrooted-tree.qza \
--o-rooted-tree rooted-tree.qza

cp rooted-tree.qza data_MicrobiomeAnalyst/

# 生成物种注释文件
qiime feature-classifier classify-sklearn \
--i-classifier /mnt/e/bioinfo/storage/QIIME2/classifier/database/classifier_G_799F-1193R.qza \
--i-reads ASV_reps.qza \
--o-classification taxonomy.qza

cp taxonomy.qza data_MicrobiomeAnalyst/

文件处理同上文中2.2

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附：

1.安装Biological Observation Matrix (BIOM)

# 创建环境
conda create -n biom

# 进入环境
conda activate biom

# 安装numpy支持包
conda install numpy

# 安装biom
conda install -c conda-forge biom-format

# biom转换为txt
conda activate biom
biom convert -i feature-table.biom -o table.txt --to-tsv

2.OTU/ASV table(Taxonomy labels included)不能生成Phylogenetic Tree Analysis