qiime2 merge结果不理想？FLASH2 合并双端数据参数调整教程！

写在前面

16S rRNA v3v4区双端测序数据的基本处理通常是qiime2导入数据，进行数据质量评估，质量过滤，merge，降噪，去嵌合。在处理过程中，发现双端数据仅有不到50%的数据可以合并，尽管稀释曲线显示平稳，但是丢失大量数据仍旧可惜。因此使用FLASH2软件先对双端数据进行合并，之后对合并数据按照单端数据导入qiime2进行后续分析。

举例展示FLASH2 参数调整方法

flash2
-r 292 \ # 读长
-f 469 \ # v3v4区片段长度（806-338+1=469）
-s 47 \ # 片段长度标准差，约为片段长度的10%（软件推荐10%，所以合并后长度范围：469±47 ）
-Q 20 \ # 测序过程中每个碱基的质量得分阈值，如果一个碱基的质量得分低于这个限值，该碱基就会被认为是低质量的，并可能被过滤掉。
-C 50 \ # 百分比截止值，先使用默认值
-m 50 \ # 最小重叠长度,(当Q>=20时，reverse在220处质量差，因此剩下得72nt（292-220）至少和forward重叠)
-M 162 \ # 最大重叠长度，涵盖片段变异范围(根据s标准差设定，片段最短为422，因此最大重叠长度为292*2-422=162)
-x 0.3 \ # 最大错配密度，默认0.25(适当放松阈值)
–allow-outies \ # 允许检测“outie”配对

注意：

（1）flash2 重叠区域碱基对不匹配的位置以质量分数高的碱基为准
（2）建议使用seqkit stats *.extendedFrags.fastq 统计每个样本合并后的长度和数量，并删除合并后长度较短的序列

参考文献

Tanja Magoč, Steven L. Salzberg, FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies, Bioinformatics, Volume 27, Issue 21, November 2011, Pages 2957–2963, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr507