利用Tbtools设计定量引物并进行BLAST验证特异性

流程

一、利用Tbtools中Batch q-PCR Primer Design插件设计引物

二、利用Tbtools中将引物转换格式Fasta to Table Convert将.xls格式的引物转为fasta格式

三、利用Tbtools中Primer Check 插件检查引物特异性

一、利用Tbtools中Batch q-PCR Primer Design插件设计引物

1.下载所需基因的CDS,支持直接粘贴或fasta文件格式，并设置输出文件位置、文件名及扩展名，将输出引物对数量设置为2，点击start，等待输出结果。

输出结果为表格，显示引物的Tm值及产物大小等信息，每两行为一个引物对，输入3个基因，每个基因两对引物，共12条引物。

二、利用Tbtools中将引物转换格式Fasta to Table Convert将.xls格式的引物转为fasta格式

1.将表格红框中的内容复制，并打开Fasta to Table Convert插件，选择seq input,并粘贴复制内容，随后选择Table to fasta，输出中选择Output Textarea,点击Convert转换

三、利用Tbtools中Primer Check 插件检查引物特异性

1.打开Prime Check 插件

2.输入需要Blast的数据库（这里使用番茄ITAG4.1CDNA数据库，下载地址Index of /ftp/genomes/Solanum_lycopersicum/annotation/ITAG4.1_release/），下载完成后点击 +“+” ，添加数据库。

3.找到下载的序列，点击 OK 等待数据库添加完成

4.复制上一步转换格式的引物，选择Paste Input，粘贴复制的引物，在output中选择 file Output，并设置文件位置、文件名和扩展名；若勾选Gellmage则会输出预测的跑胶电泳图。

5.点击start进行分析

6.输出结果，B列为1则只有一个扩增片段，若为2则有两个扩增片段，选择扩增片段为1的引物对作为定量引物。