宏基因组（鸟枪法测序）—微生物同源基因引物设计

1.获取功能基因核酸序列（宏基因组操作，在服务器上进行）

•从prokka输出文件中的ffn中获取序列信息，碱基序列长度及结构，数量信息

2.获取参考序列（普通计算机）

•在Nucleotide BLAST: Search nucleotide databases using a nucleotide query进行核酸比对，获得参考序列物种、覆盖率、相似度、ID号、碱基序列和长度等信息

(1)对于非细菌全基因组测序序列，直接作为参考基因序列；根据基因登录号在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/batchentrez? 批量下载基因序列和gff注释文件。

(2)对于全基因组序列，则通过wstools2获取该功能基因位置信息，在通过TBtools（v0.66）Quence Toolkits  中的 Fasta Tools 的 Fasta Subseq （Basic）工具，获得功能基因全长序列，需要注意的是，该基因的正反向问题，如果是反向序列，需要在Fasta Tools 中的Sequence Manipulate （Rev&Comp）进行反补；

 

将测序所得功能基因序列，和ncbi比对所得参考序列，序列编好序号后，合成一个fas文件；

3.构建系统发育树（普通计算机）

（1）MEGA5 打开序列fas文件，MUSCLE工具进行序列 Align，用默认参数，Compute；完成后data 中 phylogenetic analysis，选择非蛋白（no），构建系统发育树；选用ML（Maximum Likelihood）树的kimura2模型，选择bootstrap 检验，值设置为1000 ；关于模型选择了解学习可以参考网址https://www.cnblogs.com/xiaojikuaipao/p/7184625.html；

建树完成后，导出mts树和nwk文件

4.MEME查找motif（普通计算机）

打开MEME网址Introduction - MEME Suite，将序列上传至网站；输入邮箱和任务简介（方便以后查找和比较）；参数选项中，设置motif长度为15-20，given strand查找；一般10 min内可以得到结果，下载结果文件MEME.xml或者MAST.xml;

打开MEME_HTML，下载PDF文件，查看没有两条motif（引物两端），再综合1中excel序列比对信息，如果序列数量很少，或者比对结果中覆盖率（50%）或者相似度较低（70%），或者motif距离与其他序列中相差太远，则放弃该序列在该类群中的引物设计。

重新设计后，按4中重新查找motif后，打开MEME_HTML，打开motif，Download；

下载motif序列；在 WebLogo - Create Sequence Logos 中，重新设计美化motif序列图标；下载最终用于发表文章的motif logo的pdf文件

5.功能结构域获取

将建树序列导入DNA序列翻译成氨基酸序列 - 在线工具 - 纽普生物 - NovoPro进行批量蛋白氨基酸翻译，获得的序列导入 批量去除回车键.exe 工具中去除星号和回车键,整理合适的氨基酸序列fas文件,然后导入 Pfam is now hosted by InterPro 中进行pfam结构域查找，输入常用邮箱地址。处理时间不定，30条序列可能需要一小时或者半天，结果会发到邮箱中，整理成excel表格。

采集序列号，氨基酸起始和终止位点，以及保守结构域名称，存成名称为Pfam的txt格式文件。

除此之外，还要自制一个gff3文件，定位CDS长度，按要求制作好后存成txt格式的gff3文件。

6.TBtools中进行系统发育树，基因结构，引物序列可视化（普通计算机）

把前面整理好的文件按提示输入，按start进行绘制；得到图片后进行简单修改后到处PDF文件；

右键，cds，选择Elements Editors中的Group Elements，将Elements Type改为 Line格式

结构图上改为直线模式；

7.AI文章图片（普通计算机）