scRNA-seq | 吐血整理的单细胞入门教程（初步降维及可视化）（八）

1写在前面

上一期我们介绍了质控（quality control, QC）的意义和方法。
本期我们介绍一下高表达基因的可视化，以及简单的主成分分析（PCA）。🥰

2用到的包

rm(list = ls())
library(tidyverse)
library(SingleCellExperiment)
library(scater)

3示例数据

这里我们用一下之前介绍的counts文件和annotation文件，然后通过SingleCellExperiment创建SingleCellExperiment格式的文件，并且经过初步过滤，ID转换等。

load("umi.Rdata")
umi

4高表达基因的可视化

4.1 初步绘图

这里我们可以看到高表达的多是一些线粒体或核糖体基因。
不过大多数的dataset都是这样的。😂

umi %>% 
plotHighestExprs(exprs_values = "counts", 
                 feature_names_to_plot = "SYMBOL", 
                 colour_cells_by="detected")

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4.2 过滤一下

这里我们过滤一下看看，过滤条件：

• 在 2个或更多细胞中检测到的基因；
• counts > 1。

keep_feature <- nexprs(umi, byrow = TRUE, detection_limit = 1) >= 2
rowData(umi)$discard <- ! keep_feature
table(rowData(umi)$discard)

在这里我们过滤掉了4205个基因。

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4.3 正式过滤

我们先取个log吧，并存在umi里，然后再用前面的过滤条件过滤一下。

assay(umi, "logcounts_raw") <- log2(counts(umi) + 1)

umi.qc <- umi[! rowData(umi)$discard,! colData(umi)$discard]

5降维与可视化-PCA

5.1 PCA

我们常用的降维方法包括PCA、UMAP和tSNE。🤒
Note! 👀 这里需要跟大家强调一下log-transformation和normalization的重要性。

5.2 质控前

举个栗子🌰
不进行log-transformation或normalization。
聚成一团，根本没法看啊。🫠

umi <- runPCA(umi, exprs_values = "counts")
dim(reducedDim(umi, "PCA"))
plotPCA(umi, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")

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取个log 🥳
在这里我们用下之前做完log-transformation后的数据。
可以看到不同replicate, individual, sequencing depth，明显分开，形成一个个小的group。😘

umi <- runPCA(umi, exprs_values = "logcounts_raw")
dim(reducedDim(umi, "PCA"))
plotPCA(umi, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")

Note! 这里我只做了log-transformation,大家在实际应用中还应纳入normalization，CPM、TPM等方法，大家自行挑选吧。

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5.3 质控后

我们来看一下过滤掉表达低的基因后有什么变化吧，当然也是要取log的。😂

umi.qc <- runPCA(umi.qc, exprs_values = "logcounts_raw")
dim(reducedDim(umi.qc, "PCA"))
plotPCA(umi.qc, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")

这里可以看到NA19098.r2经过质控后，不再形成一组离群值了。
Note! 这里说明一下，scater包在计算PCA时，只用了top 500的基因，如果想改的话可以使用ntop。

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😉 嘿嘿，我们试一下用所有基因来做PCA试试。(^▽^)

umi.qc <- runPCA(umi.qc, exprs_values = "logcounts_raw", ntop = nrow(umi.qc))
dim(reducedDim(umi.qc, "PCA"))
plotPCA(umi.qc, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")

6降维与可视化-tSNE

6.1 质控前

set.seed(123)
umi <- runTSNE(umi, exprs_values = "logcounts_raw", perplexity = 130)
plotTSNE(umi, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")

Note! 这里补充一下perplexity一般取总细胞数/5后四舍五入取整。🤒

6.2 质控后

set.seed(123)
umi.qc <- runTSNE(umi.qc, exprs_values = "logcounts_raw", perplexity = 130)
plotTSNE(umi.qc, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")

同样的，经过质控后，NA19098.r2也不再形成一组离群值了。

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6.3 改下perplexity

我们在这里改一下perplexity，分别为10和220，看看有什么变化。

umi.qc <- runTSNE(umi.qc, exprs_values = "logcounts_raw", perplexity = 10)
plotTSNE(umi.qc, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")

umi.qc <- runTSNE(umi.qc, exprs_values = "logcounts_raw", perplexity = 220)
plotTSNE(umi.qc, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")

10

220

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最后祝大家早日不卷!~

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需要示例数据的小伙伴，在公众号回复scRNAseq获取吧！

点个在看吧各位~ ✐.ɴɪᴄᴇ ᴅᴀʏ 〰

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