三种显色方法ECL、NBT/BCIP和DAB的对比

分类	酶	显色	实验
ECL	HRP	荧光	WB化学发光检验
NBT/BCIP	AP	深蓝色至蓝紫色	碱性磷酸酶系统的IHC和WB
DAB	HRP	棕褐色	蛋白质杂交和免疫化学，过氧化物酶法

ECL
增强化学发光，一般含有鲁米诺和H2O2、发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被HRP和H2O2氧化，产生荧光，这个过程被发光增强剂加强。其中，增强剂在体系中扮演着核心角色，决定着ECL化学发光的发展。
理想的发光增强剂是：（1）发光灵敏，目前一般的发光增强剂都可以将发光灵敏度提高1000倍至100000倍以上；（2）发光稳定，这是目前研究的重点之一，发光不稳定的增强剂，容易在一些情况下发生“淬灭”，不容易被检测到；（3）本底或背景低，这也是发展的方向之一，欲得到准确可靠的结果，就必须确保试剂的特异性，在无HRP或很少HRP的情况下，不发光或很少发光。
NBT/BCIP
NBT+BCIP是碱性磷酸酶最佳的底物组合之一。在碱性磷酸酶（AP）的催化下，BCIP会被水解而产生强反应性产物，该产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色化学物。该试剂盒可用于碱性磷酸酶系统的IHC和WB实验的酶促显色。在AP的催化下，在组织切片或印迹膜上结合了AP偶联物的地方产生深蓝色沉淀，可根据颜色反应来确定目的蛋白的位置及表达情况。
DAB
二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是过氧化物酶的显色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成棕褐色不溶性产物，并就地原位沉淀。显色反应原理如下：

HRP＋H2O2+DAB→HRP＋H2O＋氧化型DAB↓

该方法特异性好，性能稳定，操作便捷，适用于蛋白质杂交和免疫化学，其终产物可直接在普通环境下观察，但灵敏度是这三种方法中最低的，仅能达到500pg。

综上所述，ECL和DAB都是HRP的底物，NBT/BCIP的酶是碱性磷酸酶。而且三者的颜色显示不同，DAB的显色是棕褐色，NBT/BCIP显蓝色，ECL显荧光。在灵敏度方面，ECL化学发光的灵敏度最高，为1~5pg，也有达到fg级的，BCIP/NBT的灵敏度100pg，DAB的灵敏度最低，大约为500pg。在试验中进行选择时，可根据不同的酶以及灵敏度等进行选择，并且注意操作时应佩戴手套，避免将显色剂与皮肤接触，用后及时彻底冲洗。