WB（Western Blot）显色方法怎么选？

     前面我们已经对Western Blot实验中经常遇到的问题进行总结，问题涉及到WB的各个步骤。其中，封闭和一抗的选择余地不大，二抗的作用是信号扩增，是根据一抗的标记形式而定的。对于无标记一抗，可以选择对应一抗来源种属的二抗，或者Protein A。不过，二抗更可靠的选择是除了对应一抗的种属来源，还需要根据你选择的检测方法选择合适的标记。

 

底物显色是最后一步，也是最有文章可做的一步。显色的标记方式有生物素标记、地高辛标记、各种酶标记等等，酶标的底物又有各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物可供选择，显色方法多种多样，下面我们针对常用的几类方法进行总结对比分析，供大家方便在以后实验中根据自己需求进行选择。

 

酶促反应较生物素安全且反应快速，是WB中的主流显色方法。酶促反应根据不同底物显色方法又包括化学发光和底物显色。化学发光法灵敏度高，可以达到pg级，而底物显色由于直接显色而操作简单且成本低。最为大家所熟悉的底物显色当数HRP（辣根过氧化物酶，Horseradish Peroxidase）和AP（碱性磷酸酶，Alkaline Phosphatase）。

 

HRP

 

这是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于HRP比活高、分子量小、特异性强、稳定性好和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP的底物主要包括化学发光底物和生色底物两大类，对于底物的选择，主要考虑的是灵敏度、背景和使用的方便性和稳定性。

 

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