祖先序列重构拓展三萜2"-O-糖基化酶底物谱| 清华大学李春联合北理工冯旭东最新ANGEW...

1. 论文的研究目标和意义

本论文在2024年8月22日在线发表于ANGEW。旨在开发高效的生物催化剂,用于合成带有线性三糖的三萜皂苷。三萜皂苷是一类重要的植物天然产物,在医药和农业领域有广泛应用。然而,由于其疏水的碳骨架,三萜皂苷的水溶性较差,限制了其生物利用度和临床应用。糖基化修饰,尤其是三糖修饰,可显著提高其水溶性和药理活性。

Glycosylation is a crucial method for the structural modification of triterpenoids by introducing various glycosyl groups, which not only enriches their molecular library, but also markedly enhances their water solubility and pharmacological activity. Trisaccharide modification (including linear and branched trisaccharide) is an important type of glycosylation for triterpenoids, which is of great significance for improving their pharmacological activity.

目前,化学合成和酶促合成是糖基化修饰的两种主要方法。相比化学合成,酶促合成具有反应条件温和、区域选择性和立体选择性高等优点。

**UDP-糖基转移酶(UGTs)**是催化天然产物糖基化的主要酶。然而,能够合成带有线性三糖的三萜皂苷的UGTs非常稀少,限制了相关三萜皂苷衍生物的酶促合成。因此,挖掘和定向进化高效的UGTs对于拓展三萜皂苷的分子多样性和开发新型三萜类药物具有重要意义。

2. 论文提出的新思路和方法

论文系统鉴定了UGT91H亚家族的底物特异性,发现该亚家族主要催化三萜的2"-O-糖基化,具有高度的区域选择性。为进一步拓宽底物适用范围,论文利用**祖先序列重构(ASR)**技术,构建了UGT91H亚家族的一系列祖先酶。

This study revealed that the UGT91H subfamily primarily contributed to the 2"-O-glycosylation of triterpenoids with high regioselectivity, then the substrate scope was further expanded by ancestral sequence reconstruction (ASR).

ASR通过系统发育分析推断祖先酶的氨基酸序列,并人工合成祖先酶。相比野生型酶,重构的祖先酶通常表现出更高的活性、热稳定性和底物适用范围,同时可用于阐明酶的催化机制和进化轨迹。以重构的祖先酶UGT91H_A1为模型,论文探究了UGT91H的序列-结构-功能关系,鉴定了一个影响底物特异性的关键序列片段(RTAS loop)。

此外,论文还开发了系统发育指导的UGTs挖掘策略,通过序列比对和进化分析,快速从植物基因组数据中发现新的UGT91H家族成员。

Finally, we developed a phylogeny-based platform to efficiently mining new UGT91Hs from plant genomic data.

3. UGT91H 亚家族主要催化三萜2"-O-糖基化反应,具有高度区域选择性

作者系统鉴定了 UGT91H 亚家族7个酶对30种结构多样的三萜底物的糖基转移活性。酶活检测结果表明,UGT91Hs 专一性地催化 C3 位羟基上含二糖链的三萜底物的2"-O-糖基化反应,对供体底物 UDP-鼠李糖具有最高的选择性。

This study revealed that the UGT91H subfamily primarily contributed to the 2"-O-glycosylation of triterpenoids with high regioselectivity, then the substrate scope was further expanded by ancestral sequence reconstruction (ASR).

作者进一步比较了含不同二糖取代基的底物的反应转化率(表1),发现 UGT91Hs 对 GlcA-Glc、GlcA-Gal 型底物的催化效率最高,对含 Ara 或 Fuc 二糖链的底物无活性。这一发现揭示了供体和受体底物结构特征对 UGT91Hs 催化活性的调控规律,为合理设计反应底物奠定了基础。

4. 祖先序列重构拓宽了 UGT91H 的底物适用范围

为进一步拓展 UGT91Hs 的底物适用范围,作者利用祖先序列重构(ASR)技术,构建了 UGT91H 亚家族的一系列祖先酶(图3a)。酶活检测发现,最古老的重构酶 UGT91H_A1 获得了催化含阿拉伯糖二糖链底物16-18的新活性,转化率可达80%以上,而现存的 UGT91H 酶均无法催化这些底物。

UGT91H_A1 showed a newly discovered activity with a conversion of over 80% for substrates 16, 17 and 18 possessing Ara as the first glycosyl on the disaccharide chain at C3-OH, which were not recognized by extant UGT91H enzymes (Fig. S53-S55).

图3

此外,UGT91H_A1 对供体底物的适用范围也有所拓展,可利用 UDP-木糖和UDP-葡萄糖催化16-18的糖基化反应。动力学研究表明,UGT91H_A1 对 UDP-鼠李糖的催化效率高于 UDP-木糖和 UDP-葡萄糖。产物的核磁共振分析证实,UGT91H_A1 保留了 UGT91H 酶2"-O-糖基化的高度区域选择性。综上,ASR 策略成功优化了 UGT91H 酶的底物适用范围和催化活性,为生物合成多样性的三萜皂苷衍生物提供了新的酶学工具。

5. RTAS loop 影响 UGT91H 酶的底物特异性

为阐明 UGT91H 酶的结构-功能关系,作者比较了 UGT91H_A1 与同源性最高(84%)的现存酶 UGT91H8 的底物特异性差异。定点突变实验鉴定了一个影响底物选择性的关键氨基酸片段 RTAS (R212/T213/A214/S215)。

A RTAS loop (R212/T213/A214/S215) was identified to affect the substrate specificity of UGT91H_A1. Transferring this RTAS loop to the corresponding position of UGT91H enzymes successfully expanded their substrate spectra.

将 RTAS 引入 UGT91H8,获得的突变体 UGT91H8_6mu 对底物 17 的催化活性由0提升至15.9%。

Only mutant UGT91H8_6mu showed new activity in catalyzing the rhamnosylation of 17 with a conversion of 15.9 ± 0.5%, and also achieved a 7.7 ± 0.8% conversion for the xylosylation of 17 (Fig. 4c and Fig. S89).

图4

分子动力学模拟和量子力学计算进一步揭示,RTAS 可影响酶-底物结合能和相互作用模式,从而调控 UGT91Hs 的底物特异性(图5)。

具体而言,RTAS 突变体与底物形成了更多的氢键和疏水相互作用(图5a);在 UGT91H8_6mu 的模拟体系中,S212与二糖上的鼠李糖单元形成稳定的氢键,而野生型酶无法形成这一关键相互作用(图5b);RTAS 突变体与底物 17 和 UDP-鼠李糖的结合能显著低于野生型酶(图5c)。

In the complex of UGT91H8_6mu, nine residues (H30, N100, S212, E296, H368, S371, E376, D392, and Q393) formed hydrogen bonds with the substrates, while six residues (Y32, I151, F130, F160, L203, and L215) were engaged in hydrophobic interactions with the substrates. Therefore, UGT91H8_6mu formed more interactions with the substrate, facilitating the substrate recognition and catalysis.

The relative energy of both the initial state (-127.2 kcal/mol) and final state (-175.2 kcal/mol) of UGT91H8_6mu was significantly lower than those of UGT91H8 (Table S9). These results indicated that UGT91H8_6mu preferred the rhamnosylation of 17 due to the lower binding energies.

这些结果阐明了 RTAS 调控 UGT91H 酶底物选择性的分子机制,为 UGTs 的理性设计提供了新思路。

图5

5. 耦合 UDP-糖再生系统实现三萜皂苷的高效酶促合成

作者将 UGT91H_A1 与自循环再生 UDP-鼠李糖的四酶级联系统偶联,成功实现了三萜皂苷 2a 和 17a 的高效制备(图6),转化率分别达80%和61%。

After 12 h of reaction,the amount of 2a reached 160.1 ± 0.6 μM, and the conversion of 2 increased to 80.1 ± 0.3%. Likewise, 17a was produced at amount of 122.7 ± 8.3 μM with a conversion of 61.3 ± 4.1% after 12 h reaction (Fig. 6).

该体系利用廉价的蔗糖为原料,原位补充 UDP-鼠李糖,克服了糖供体昂贵和产物抑制等限速因素。这一结果展示了将糖基转移酶与 UDP-糖再生系统耦合,发展三萜皂苷绿色酶促合成新工艺的可行性和应用前景。

图6

6. 系统发育指导的蛋白挖掘策略迅速拓展 UGT91H 家族

基于已鉴定的 UGT91H 酶,作者开发了系统发育指导的蛋白挖掘新策略。利用序列比对和进化分析,从8种豆科植物的基因组数据库中新发现了19个 UGT91H 酶(图7a)。

Following this thought, a total of 23 candidate UGTs were discovered from 8 leguminous plants containing abundant triterpenoid glycosides (Table S10), using the sequences of 9 extant UGT91H enzymes as the template. Among them, 19 UGTs belong to the UGT91H subfamily and 4 UGTs belong to a novel UGT91BQ subfamily.

初步酶活检测表明,其中 UGT91H19 和 UGT91H20 不仅能催化底物 1 的鼠李糖基、木糖基和葡萄糖基化,还表现出新颖的半乳糖基转移活性(图7b)。

Notably, UGT91H19 and UGT91H20 not only catalyzed rhamnosylation, xylosylation and glucosylation of substrate 1, but also showed activity in the galactosylation of 1, yielding products 1a, 1b, 1c and 1d. Although the conversion of galactosylation of 1 was only 6.8 ± 0.1%, this activity was not possessed by UGT91Hs reported to date.

这些结果验证了该挖掘策略在快速拓展 UGT 家族、发现新型糖基转移活性方面的有效性,为 UGTs 的功能挖掘提供了新思路。

图7

7. 论文成果的影响和应用前景

本研究为带线性三糖的三萜皂苷的生物合成提供了高效的生物催化剂,极大拓展了三萜皂苷的化学空间和结构多样性,为开发新型三萜类药物奠定了基础。论文创新性地将ASR和系统发育分析应用于UDP-糖基转移酶的功能优化和新酶挖掘,为UGTs的定向进化和底物工程提供了新策略和技术路线。后续研究可聚焦于以下几个方面:

1. 进一步优化UGT91H_A1及突变体的催化活性和底物适用范围,实现更多新型三萜皂苷的酶促合成。

2. 解析UGT91Hs的蛋白结构,阐明酶-底物识别和催化反应的分子机制,指导后续的理性设计。

3. 优化UDP-糖供体的原位再生系统,开发绿色高效的三萜皂苷酶法制备新工艺。

4. 评价新型三萜皂苷衍生物的理化性质和药理活性,筛选先导化合物,开展药物开发。

8. 研究展望与投资机会

三萜皂苷及其衍生物在抗肿瘤、抗炎、抗病毒等领域具有广阔的应用前景。酶法合成可显著提升三萜皂苷的结构多样性,加速新药研发进程。UDP-糖基转移酶的定向进化和催化机制研究,有望突破天然产物糖基化修饰的技术瓶颈,催生出新一代绿色制药技术。此外,UDP-糖再生系统与其他糖苷合成酶的耦合,将拓宽UDP-糖依赖型酶促合成反应的应用场景。

9. Critical Thinking

• 论文侧重于酶的底物适用范围和催化机制研究,对于产物的结构表征略显不足。后续研究需进一步分析所合成三萜皂苷的理化性质及生物活性。

• 实验主要在体外酶活检测的水平开展,缺乏对三萜皂苷的制备工艺优化和规模化生产的探索。后续需评估全细胞催化及强化发酵策略,提升三萜皂苷的生产效率与经济性。

• 尽管RTAS Loop被鉴定为影响酶底物特异性的关键区域,但其作用机制有待进一步实验证实。比如,可通过定点突变和酶活检测,分析RTAS Loop中关键氨基酸残基的作用;或解析野生型酶和突变体的蛋白结构,阐明底物结合模式的差异。

• 虽然ASR和系统发育分析被证实可有效指导UDP-糖基转移酶的功能优化和新酶挖掘,但这一策略能否推广至其他类型的糖基转移酶,尚需更多案例研究。同时,ASR重构的祖先酶与现存酶的活性差异及进化机制有待深入探讨。

• 论文主要关注三萜皂苷的2"-O-糖基化修饰。对于其他位点的糖基化反应(如3'-O-糖基化),以及寡糖链的连续延伸反应,尚缺乏系统研究。这可能需要发掘和设计新的糖基转移酶体系。

Biosyn导师：李春

https://www.chemeng.tsinghua.edu.cn/info/1094/2413.htm

李 春    教授 电话：010-62799893 地址：清华大学英士楼 邮件：lichun@tsinghua.edu.cn

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长期从事代谢工程与合成生物学、生物催化与酶工程的研究，聚焦甘草萜烯类和黄酮类天然产物的酶转化与微生物合成，工业菌种智能抗逆分子设计与工程应用。2014年获国家杰出青年科学基金，2019年担任国家重点研发计划 “合成生物学”专题首席科学家。已完成植物油脂酶法脱胶、甘草次酸的生物制造、多重耐热酵母发酵生产乙醇等技术的中试试验，研制的植物解盐促生菌剂实现了产业化应用。在ACS Catal、ACS Energ Lett、Nature Comm、Metabolic Eng、ACS Synth Biol、AIChE J、Chem Eng Sci、J Biol Chem、J PhyChem Letter等期刊发表论文近300余篇，获授权发明专利36项，获省部级科技成果奖4项。编著教材和专著11部章，其中主编的《合成生物学》、《生物工程与技术导论》和副主编的《生物化学》已成为高校广泛使用的教材。2006年享受国务院政府特殊津贴，2017年获得“侯德榜化工科技创新奖”，2017年遴选为全国“生物工程学”首席科学传播专家。现担任中国化工学会生物化工专委会副主任、中国生物工程学会合成生物学专委会副主任；担任《合成生物学》执行主编、《Frontiers in Bioeng Biotechnol》副主编、《Applied Microbio Biotechnol》、《Synth System Biotechnol》、《化工进展》、《催化学报》、《过程工程学报》、《农业工程学报》、《生物加工过程》等期刊编委。

●  教育与工作经历

2020.04– 至今     清华大学化学工程系   长聘教授

2017.09 –2020.04  北京理工大学特聘教授、化学与化工学院副院长，化学工程与技术学科责任教授

2011.02 –2012.01  美国伊利诺伊大学香槟分校（UIUC）化工与生物分子工程系从事合成生物学研究

2006.05 –2017.09  北京理工大学百人计划教授、生物工程系主任，学科责任教授

2003.10 –2006.05  石河子大学教授、校长助理，建立化学化工学院并担任首届院长

2001.08 –2003.10  清华大学化学工程系   生物化工博士后

1998.02 –2001.08  天津大学化工学院    生物化工 博士

1997.08 –1998.02  天津科技大学  发酵工程   进修

1997.07 –1997.08  中国农业大学  食品生物技术 培训

1995.07 –1997.06  石河子大学 食品工程学院实验中心主任，讲师

1992.08 –1995.06  石河子大学    微生物学   硕士

1988.09 –1992.07  石河子大学    植物保护   学士

●  研究领域

1）天然产物的微生物合成与生物转化；2）工业微生物的抗逆分子设计与工程应用；3）生物催化与酶工程。

Biosyn导师：冯旭东

https://cce.bit.edu.cn/szdw/jsml/swhgyjs/8e0e4d389db542338a32af6285261fd3.htm

个人简介

冯旭东，长聘副教授（特别研究员），博士生导师。2014年在奥克兰大学（新西兰）获工学博士学位，同年加入北京理工大学做师资博士后（合作导师为李春教授），出站后留校任教。目前担任化学与化工学院生物化工研究所副所长、生物化工学科方向责任教授。研究领域包括生物催化与酶工程合成生物学，研究内容主要包括植物天然产物合成与改性过程中关键酶的挖掘、改造及工程化应用。2019年入选北京市科技新星计划。担任《Frontiers of Chemical Science and Engineering》青年编委、《合成生物学》编委。

研究领域和方向

研究领域：（1）生物催化与酶工程；（2）合成生物学。
研究方向：以植物天然产物合成过程中关键酶的挖掘、工程化改造及应用为主要研究内容，利用蛋白质结构解析结合计算机模拟技术，研究酶的结构和功能之间的构效关系；通过蛋白质工程手段对酶的稳定性、活性、底物特异性等方面进行分子改造，获得满足工业化需求的高效酶制剂；通过构建无细胞催化体系或微生物细胞工厂高效合成植物天然产物，利用生化反应工程及代谢工程的策略对生物转化过程进行强化，为实现其产业化提供理论指导。
目前指导在读博士生4人、硕士生8人，已毕业博士生2人、硕士生6人。团队经费充裕，科研氛围良好，每年有1名博士生、2-3名硕士生招生指标，欢迎志同道合的学生加盟本团队，通过科研的磨练升华自己！

教育背景

2010.04-2014.06 奥克兰大学（新西兰），化学工程专业，工学博士
2007.09-2009.06 天津大学，生物化工专业，工学硕士
2003.09-2007.07 河北工业大学，生物工程专业，工学学士

工作履历

2021.07-至今 北京理工大学，化学与化工学院，长聘副教授（特别研究员）
2017.12-2021.06 北京理工大学，化学与化工学院，助理教授
2016.10-2017.11 北京理工大学，生命学院，助理教授
2014.07-2016.09 北京理工大学，生命学院，师资博士后（合作导师：李春教授）

研究成果

先后主持国家自然科学基金3项、国家重点研发计划子课题2项、省部级及企业委托项目5项，总经费1000余万元。以第一作者或通讯作者在Biotechnol Adv, Nat Prod Rep, Crit Rev Biotechnol, Biotechnol Bioeng, Green Chem, AIChE J, Appl Environ Microb, J Agr Food Chem, Chem Eng Sci, Bioresource Technol等主流期刊发表论文36篇，获授权国家发明专利11项，申请PCT专利1项。在国内外学术会议做报告10余次，获优秀口头报告奖2次。指导学生获iGEM金奖2次、研究生国家奖学金2次。

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