催化薯蓣皂苷3-O-葡萄糖苷的生物合成-文献精读74

Identification and functional characterization of DzS3GT, a cytoplasmic glycosyltransferase catalyzing biosynthesis of diosgenin 3-O-glucoside in Dioscorea zingiberensis

盾叶薯蓣细胞质糖基转移酶DzS3GT的鉴定及功能特征研究：催化薯蓣皂苷3-O-葡萄糖苷的生物合成

摘要

薯蓣属植物能够生成药用薯蓣皂苷，通常以皂苷的形式存在于植物中，七十多年来一直作为类固醇生产的起始原料。类固醇皂苷从相应的甾体皂苷元开始生物合成的第一步是通过3-O-甾醇糖基转移酶（S3GT）进行糖基化，将糖供体的糖基转移至甾体皂苷元的3-OH位置。在本研究中，从盾叶薯蓣中克隆并在大肠杆菌中表达了DzS3GT基因，重组DzS3GT蛋白在体外表现出3-O-甾醇糖基转移酶活性。亚细胞定位分析显示，DzS3GT蛋白位于水稻原生质体的细胞质中。DzS3GT的组织表达谱与已报道的SGT基因不同，该基因在叶片中高表达，而在茎中表达极低。薯蓣皂苷3-O-葡萄糖苷（薯蓣皂苷）的含量在叶片中显著高于其他器官。基因表达特异性及皂苷积累表明，薯蓣皂苷可能主要在盾叶薯蓣的叶片中合成。这是首次报道参与薯蓣皂苷3-O-葡萄糖苷生物合成的糖基转移酶基因的克隆及生化特征研究。此外，该研究还为薯蓣属植物中类固醇皂苷的生物合成及运输机制提供了潜在的参考。

引言

一些植物，例如薯蓣、香青兰、菝葜、重楼、葫芦巴、黄精和延胡索等，能够生成药用薯蓣皂苷，通常以皂苷形式存在于植物中，并在七十多年来一直作为类固醇生产的起始原料 (Ding et al., 1983; Jasim et al., 2015; Marker et al., 1940)。类固醇皂苷因其类固醇氧化和糖基化模式的多样性而在结构上有所不同 (Challinor et al., 2013; Wang and Hou, 2008)，这可能与一系列生物活性相关，如细胞毒性 (Wen et al., 2015)、抗溃疡 (Júnior et al., 2015)、降脂、抗炎、抗氧化和抗真菌等作用 (Sparg et al., 2004; Weng et al., 2014)。糖基化不仅可能有助于稳定产物，还可能在调节其生物活性和控制细胞内分布方面发挥作用 (Bruyn et al., 2015; Schuler et al., 1991; Ullmann et al., 1993; Webb et al., 1995)。然而，与类固醇皂苷生物合成相关的糖基转移酶（GTs）尚未得到广泛研究。

类固醇皂苷由相应的皂苷元开始生物合成的第一步是通过3-O-甾醇糖基转移酶 (S3GT) 催化的糖基化，将糖供体的糖基转移至皂苷元的3-OH位置。植物SGTs的常见糖供体通常是UDP-葡萄糖 (Warnecke et al., 1997)，以及UDP-半乳糖 (Kohara et al., 2005)、UDP-甘露糖 (Eichenberger and Menke, 1966) 和UDP-木糖 (Iribarren and Pomilio, 1984)。SGT属于CAZY (碳水化合物活性酶) 数据库中描述的94个GT家族之一的家族1 (CAZy - Home)，通常具有广泛的底物特异性 (Cantarel et al., 2009)。例如，来自Gymnema sylvestre的GsSGT能够糖基化不同种类的甾醇，如胆固醇、麦角甾醇和豆甾醇 (Tiwari et al., 2014)。来自Solanum aculeatissimum的SaGT4A可以同时糖基化类固醇皂苷元和类固醇生物碱 (Kohara et al., 2005)。目前，已在一些植物中对S3GT进行了分子层面的功能特征研究，包括燕麦 (Warnecke et al., 1997)、刺茄 (Kohara et al., 2005)、睡茄 (Madina et al., 2007)、拟南芥 (Debolt et al., 2009) 和木蝴蝶 (Tiwari et al., 2014)。使用RACE（cDNA末端快速扩增）方法克隆了四个全长的SGTs。在茉莉酸甲酯或水杨酸处理后，SGT基因的表达显著上调，表明它们在植物防御机制中的潜在作用 (Saema et al., 2016)。

植物中的SGTs具有多种重要的生物学功能，可调节甾醇的生物活性，例如增强甾醇的水溶性、分子稳定性及改变细胞膜的生物物理特性，从而促进运输系统的进入，并帮助植物适应环境变化 (Chaturvedi et al., 2011; Debolt et al., 2009; Faizal and Geelen, 2013; Saema et al., 2016; Thevissen et al., 2003)。SGTs还在高等生物的生长和发育调节中发挥作用。植物由于糖基化而无法利用油菜素内酯，导致生长缓慢和发育缺陷 (Chaturvedi et al., 2011; Poppenberger et al., 2005)。此外，SGTs在植物的适应性反应中对非生物和生物胁迫耐受性以及发育事件中的代谢可塑性方面发挥重要作用 (Chaturvedi et al., 2012; Jones and Vogt, 2001; Li et al., 2014; Saema et al., 2016)。刺茄的S3GT基因在创伤胁迫下表现出增强的表达 (Kohara et al., 2005)。报道表明，将来自睡茄的WsSGTL1基因过表达于转基因拟南芥中，与适应寒冷和高温胁迫有关 (Mishra et al., 2013)。此外，在转基因烟草中过表达WsSGTL1赋予了其生物胁迫和盐胁迫耐受性，这与其增强的抗氧化系统有关 (Pandey et al., 2014)。最后，睡茄中Ws-Sgtl4基因的过表达显著提高了类固醇化合物含量，表明SGT可能是通过遗传工程来增加植物或体外培养中类固醇化合物产量的潜在靶标 (Pandey et al., 2016)。因此，识别和表征此类GTs对理解糖苷调控和植物抗逆性具有重要意义。

类固醇皂苷主要通过细胞质甲瓦龙酸途径中的一个分支通过环阿藤醇进行生物合成，通常储存在液泡中以防止植物自毒 (Gupta et al., 2004; Sirikantaramas et al., 2008; Zhao et al., 2013)。此外，推测类固醇皂苷的皂苷元（如薯蓣皂苷）在叶片中合成，然后通过茎转运到其他组织 (Li et al., 2009; Kim et al., 2014)，但糖基化途径尚不明确。此外，糖基化通常被认为是类固醇皂苷生物合成的最后一步，能够提高其水溶性并增强化学稳定性，从而更易于在植物细胞中储存和积累 (Gleadow and Møller, 2014; Kalinowska et al., 2005)。因此，有必要研究GTs的组织和亚细胞定位，并探讨其表达特征。

盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis C. H. Wright）是中国特有的物种，由于其块茎中薯蓣皂苷含量高，是薯蓣皂苷的重要植物来源。几年份的盾叶薯蓣块茎中薯蓣皂苷含量可高达干重的16.15%，因此盾叶薯蓣在类固醇药物制造中具有重要地位 (Ding et al., 1983)。薯蓣属植物的化学成分、药理特性和组织培养技术已广泛报道 (Manoharan et al., 2016; Sautour et al., 2007)，但目前尚无关于盾叶薯蓣和其他薯蓣属植物中与类固醇皂苷生物合成相关的糖基转移酶基因或酶的鉴定和功能特征的文献。

本研究旨在通过克隆、结构对接、异源表达、酶活性检测、亚细胞定位和表达分析对来自盾叶薯蓣的一个新的DzS3GT基因进行评估。研究的第二个目标是探讨类固醇皂苷的糖基化和转运途径。本研究将有助于加深我们对不同植物系统中皂苷生物合成和调控机制的理解。

材料与方法

化学试剂、试剂和材料

盾叶薯蓣样本采自中国山西省旬阳县。采集不同生长阶段的叶片、茎和块茎组织后，立即在液氮中冷冻并储存于−80°C。常用试剂购自Sigma-Aldrich。分子生物学试剂盒和试剂购自Bioteke、Fermentas、Invitrogen、Clontech Laboratories、Takara Bio、Roche和Sigma-Aldrich。

RNA提取与反转录

将叶片、茎和块茎样本在液氮中冷冻并研磨成细粉后，部分样本立即用于总RNA提取，使用Universal Plant Total RNA Extraction Kit（Bioteke，北京，中国），按照生产商的说明进行操作。提取的总RNA经RNase-free DNase I (Fermentas, USA) 处理以去除基因组DNA污染。使用1 μg总RNA和M-MLV逆转录酶（Invitrogen，USA）按照生产商说明合成cDNA第一链。

DzS3GT全长cDNA克隆

为扩增DzS3GT基因，设计了基于3-O-糖基转移酶基因保守区域的简并引物SGT-dF和SGT-dR。PCR产物克隆至pMD-19 T Easy载体（Takara Bio，日本）并进行测序。5′-RACE和3′-RACE cDNA模板使用SMART™ RACE cDNA扩增试剂盒（Clontech，USA）合成。使用四种特定引物（SGT-sF1、SGT-sF2、SGT-sR1和SGT-sR2）进行嵌套PCR，以获取3′和5′ cDNA末端。含有假定开放阅读框（ORF）的cDNA片段被命名为DzS3GT-ORF。上述扩增的cDNA用QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen，德国）纯化，插入pMD19-T载体（Takara Bio）并转化至大肠杆菌DH5α细胞。为确定cDNA序列，选择至少10个阳性重组克隆进行测序。

生物信息学分析

使用GenBank和BLAST搜索以获得3-O-糖基转移酶同源蛋白的推导氨基酸序列。推导蛋白的分子量、理论等电点、疏水性和亲水性分析，以及信号肽和亚细胞定位预测，均使用expasy工具（http://expasy.org/tools）完成。利用保守域工具（NCBI Conserved Domain Search）分析基序和结构域。使用NetNGlyc 1.0服务器（NetNGlyc-1.0 - redirect）分析潜在N-糖基化位点；使用NetOGlyc 4.0服务器（NetOGlyc-4.0 - redirect）分析潜在O-糖基化位点；使用NetPhos 3.1服务器（NetPhos-3.1 - redirect）分析潜在磷酸化位点。采用Clustal X (2.0.10) 软件对这些同源蛋白序列进行比对和分析。

分子对接分析使用Autodock Vina软件（版本1.1.2）进行，以研究薯蓣皂苷与DzS3GT的结合模式。DzS3GT的三维（3D）结构使用Phyre2服务器（PHYRE2 Protein Fold Recognition Server）预测，并由VERIFY-3D评估。AutoDock Tools软件（版本1.5.6）用于生成对接输入文件。通过Vina对接评分选择排名最高的构象，并使用PyMOL 1.5软件进行视觉分析。

重组DzS3GT在大肠杆菌中的表达与纯化

使用含有EcoRI和Hind III限制位点的引物SGT-eF和SGT-eR扩增DzS3GT的完整ORF。PCR产物使用T4 DNA连接酶克隆至pET-28a载体，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)。挑取正确的单克隆大肠杆菌，在含100 mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37°C过夜培养。取2 mL活化的大肠杆菌接种至400 mL新鲜LB液体培养基（含100 mg/mL氨苄青霉素），37°C培养至OD600达到0.6。用0.1 mM IPTG在20°C下诱导12小时，随后以3000 rpm在4°C离心30分钟收获大肠杆菌细胞。重组蛋白的纯化使用5 mL His Trap柱（GE Healthcare，瑞典），按生产商说明操作。纯化的融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析后用于酶活性分析。

重组rDzS3GT蛋白的MALDI-TOF-MS/MS分析

目标带（分子量为70 kDa）从SDS-PAGE凝胶中切下并置于新的Eppendorf管中。凝胶条带按Komatsu等人（2016）的协议进行脱水和消化。利用Thermo Proteome Discoverer (2.1.0.81) 软件的Mascot算法分析获得的肽质量指纹。通过搜索NCBI数据库获得氨基酸序列。

酶活性测定

部分纯化的rDzS3GT蛋白酶活性测定中，使用10 μM薯蓣皂苷、胆固醇或β-谷甾醇作为底物，10 μM UDP-葡萄糖作为糖供体，30 μg纯化的重组蛋白于20 mM Tris-HCl (pH 6.5) 中进行。反应在37°C进行1小时，随后使用1.5 mL乙酸乙酯提取反应混合物。上层液体取出并在氮气下完全干燥。酶反应产物溶解于甲醇中，并在高效液相色谱（HPLC）系统和薄层色谱（TLC）系统中分析。对于TLC分析，产物点样于GF254硅胶板（青岛海洋化工，中国），移动相为氯仿:甲醇（95:5，V/V）。干燥后，用10%（V/V）的H2SO4溶液喷雾并在100°C下加热5分钟显色。对于HPLC分析，使用Agilent 1200系列HPLC系统配备的ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm内径×250 mm）（安捷伦科技，美国），在30°C下使用梯度流动（0–25分钟，水中的乙腈从75%渐变至100%），流速为1 mL/min，在203 nm处监测。

为进一步确认酶反应产物，使用Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF液相色谱-质谱（LC-MS）系统分析反应混合物。HPLC分析方法与上述相同。

pH值和温度对rDzS3GT活性的影响

通过在pH范围为4.0-9.0的不同50 mM缓冲液中测定rDzS3GT的最适pH值，所用缓冲液包括：醋酸钠（pH 4.0-5.5）、磷酸钠（pH 6.0-7.5）、Tris缓冲液（pH 8.0-9.0）。使用pH 6.5的50 mM磷酸钠缓冲液，在4–90°C范围内测定DzS3GT的最适温度。

金属离子对rDzS3GT活性的影响

通过在包含KCl、NaCl、MnCl2、CaCl2、ZnCl2、MgSO4、FeCl3或CuSO4（终浓度为5 mM）的反应混合物中测定金属离子对DzS3GT活性的影响。酶活性在上述最适温度下进行测定。

亚细胞定位

为确认DzS3GT的亚细胞定位，设计了带有Not I位点（5'端）和Asc I位点（3'端）的引物SGT-lF和SGT-lR，以扩增DzS3GT的完整ORF。PCR产物经Not I和Asc I消化后，利用T4 DNA连接酶克隆至PUC-19载体。通过LR重组酶（Invitrogen），根据Wu等人（2015）的方法，将入口载体重组至基于DsRed的pTDM-N二元载体用于N端红色荧光蛋白（RFP）融合，或pTDM-C用于C端RFP融合。正确的质粒RFP-DzS3GT或DzS3GT-RFP与GFP标记的细胞质标记物pGOM1 (Wu et al., 2015)共同转化至PEG培养基中的原生质体。在Olympus FV1000共聚焦显微镜下观察转化的原生质体。提取转化原生质体中的总蛋白，通过SDS-PAGE分离后转移至聚偏二氟乙烯膜（Millipore，美国），并使用抗GFP抗体（Sigma-Aldrich）进行免疫印迹检测。

盾叶薯蓣中DzS3GT的表达、DzS3GT活性及皂苷积累

使用特定引物SGT-qF和SGT-qR检测DzS3GT基因表达，以避免扩增污染的基因组DNA。另设计两个特异性引物Actin-qF和Actin-qR，用于扩增内参β-肌动蛋白基因（Ye et al., 2014）。在组织表达谱分析中，分别从盾叶薯蓣的幼叶、中叶、成熟叶、老叶、幼茎、老茎、幼块茎和老块茎中提取总RNA，使用Universal Plant Total RNA Extraction Kit（Bioteke）进行RNA提取。所有RNA样本按照前述方法逆转录为cDNA。qRT-PCR反应使用Fast Start Universal SYBR Green Master (ROX)（Roche，德国）和Bio-Rad CFX96实时PCR检测系统（Bio-Rad，美国）进行。反应混合物在95°C变性10分钟启动，接着进行40个循环，包括95°C变性10秒和60°C退火40秒。相对基因表达量使用CT值并通过(2^{-\Delta \Delta \text{C}_{\text{T}}})方法计算 (Kenneth and Livak 2001)。

组织样本的总粗蛋白通过将0.2 g样品在液氮中研磨成粉后提取。将粉末悬浮于2 ml提取缓冲液（50 mM Tris-HCl, pH 8.0，含5 mM EDTA、10 mM β-巯基乙醇、1 mM PMSF）中，4°C放置1小时，通过12000 rpm离心20分钟获得上清液，使用PD-10柱（GE，美国）进行脱盐后用于酶活性分析。蛋白质使用考马斯蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher, USA）定量。酶活性按照前述方法使用薯蓣皂苷和UDP-葡萄糖作为底物进行检测。

盾叶薯蓣的干样（0.05 g）使用Saema等人（2016）的方法用甲醇提取。提取液通过0.22 μm滤膜（Millipore，美国）过滤，用于特灵苷、薯蓣皂苷和总类固醇皂苷的定量测定。特灵苷和薯蓣皂苷的定性分析使用前述HPLC系统进行。总皂苷含量按照Nguyen等人（2015）描述的分光光度法测定。

结果

盾叶薯蓣DzS3GT基因的全长cDNA克隆

使用简并引物SGT-dF和SGT-dR通过RT-PCR扩增出一个核心cDNA片段（517 bp）。通过RACE技术获得5′ cDNA末端（1.0 kb）和3′ cDNA末端（1.2 kb）。DzS3GT的全长序列包括1944个核苷酸，其中包含一个1731 bp的单一ORF，编码577个氨基酸，以及34和176 bp的5′-和3′-非翻译区。

通过BLAST P进行的同源性分析显示，DzS3GT的蛋白序列与一些其他植物的SGT酶具有较高的相似性，如油棕的3-beta-SGT (79%)、二穗短柄草的3-beta-SGT (78%)、鹰嘴豆的3-beta-SGT (77%)、陆地棉的3-beta-SGT (74%)、野蕉的3-beta-SGT (78%)、矮秆稻的3-beta-SGT (78%)、枣椰树的3-beta-SGT (76%)、黍稷的3-beta-SGT (79%)和枣的3-beta-SGT (76%)（图S1）。

DzS3GT的预测特性

推导的蛋白序列分析显示DzS3GT蛋白与GTs具有特定匹配，并属于糖基转移酶GTB型超家族（图1a）。在DzS3GT中，发现了已知的SGT保守结构域，如活性位点、同源二聚界面、受体底物口袋、TDP结合位点、Glyco_transf_28结构域和glycosyl_450act结构域（图1a）。DzS3GT蛋白的分子量约为63 kDa，等电点为6.42。疏水性和亲水性分析显示该蛋白主要为亲水性。Signal P分析表明该蛋白没有信号肽。DzS3GT的亚细胞定位预测显示其位于细胞质（56.5%）、线粒体（26.1%）和细胞核（17.4%）。此外，DzS3GT被预测不含N-糖基化位点，含有13个O-糖基化位点和42个磷酸化位点（图1b–d）。

DzS3GT的生物信息学分析 a 通过NCBI保守域数据库（NCBI Conserved Domain Search）检测到DzS3GT的推测保守结构域。 b DzS3GT酶与薯蓣皂苷的分子对接结果。 c DzS3GT酶与薯蓣皂苷的相互作用详细分析。预测氨基酸Asp-144与薯蓣皂苷的3-OH位置形成氢键。 d DzS3GT的预测磷酸化位点。 e DzS3GT的预测N-糖基化位点。 f DzS3GT的部分预测O-糖基化位点。

通过底物对接分析DzS3GT与薯蓣皂苷的可能相互作用。如图1e所示，薯蓣皂苷在DzS3GT的口袋中呈紧凑构象。薯蓣皂苷的3-OH位置位于DzS3GT口袋的底部，并形成大量范德华接触，而其四氢吡喃基位于口袋入口附近，仅形成少量接触。详细分析显示关键的氢键相互作用在于薯蓣皂苷3-OH位置的羟基与Asp-144残基之间，键长为2.6 Å。底物对接模型有助于确定DzS3GT的催化机制。

DzS3GT在大肠杆菌中的表达及重组DzS3GT的鉴定

在IPTG诱导后，重组His6-rDzS3GT在大肠杆菌BL21 (DE3)中成功表达。SDS-PAGE显示在70 kDa处有明显条带（图2a，第2条）。通过IMAC纯化后，获得了95%纯度的rDzS3GT（图2a，第3条）。每升细菌培养物中可获得约2.0 mg具有特异活性的部分纯化的His6-rDzF26G。

表达的rDzS3GT蛋白的SDS-PAGE、电泳和MALDI-TOF-MS/MS分析 a 考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶和蛋白质印迹分析。泳道：M，蛋白分子量标准（Thermo Fisher, USA）；1, 4，未经IPTG诱导的转入pET28a-DzS3GT载体的大肠杆菌BL21 (DE3)细胞；2, 5，经IPTG诱导的转入pET28a-DzS3GT载体的大肠杆菌BL21 (DE3)细胞；3, 6，使用Ni–NTA树脂纯化的重组蛋白。 b 重组Dz3SGT蛋白的覆盖图。

经过胰蛋白酶消化后，使用MALDI-TOF-MS/MS鉴定纯化的重组蛋白，以获得肽质量指纹（补充图S2）。结果显示，纯化的蛋白与DzS3GT酶一致（图2b）。

rDzS3GT的酶活性分析

为了表征rDzS3GT的酶活性，使用薯蓣皂苷及另外两种甾醇作为底物。rDzS3GT以UDP-葡萄糖为糖供体催化薯蓣皂苷形成一种新产物（图3）。反应混合物通过TLC（补充图S3）和LC-MS（图4）分析。

薯蓣皂苷和特灵苷的结构。DzS3GT催化葡萄糖从UDP-葡萄糖转移到薯蓣皂苷的3-OH位置。

使用薯蓣皂苷作为底物检测rDzS3GT活性 酶反应产物的HPLC分析： a 薯蓣皂苷的标准品； b 特灵苷的标准品； c 负对照反应的乙酸乙酯提取物，使用UDP-葡萄糖作为供体且携带空载体的大肠杆菌； d 酶反应产物的乙酸乙酯提取物。 e 酶反应产物的LC-MS分析。

新产物的保留时间与特灵苷标准品相同（图4d），在LC-MS数据中显示出m/z [M + H+]为577.37的离子（图4e），从而确认新产物为特灵苷。此外，rDzS3GT还能使用UDP-葡萄糖作为糖供体对胆固醇和谷甾醇进行糖基化（补充图S4）。然而，当使用UDP-半乳糖、UDP-鼠李糖或UDP-木糖作为糖供体时，rDzS3GT对薯蓣皂苷未表现出催化活性（表1）。

Table 1 Relative rDzS3GT activity with various donor molecules

Substrates	Relative activity(%)
diosgenin + UDP-glucose	100
β-sitosterol + UDP-glucose	72.25 ± 3.32
cholesterol + UDP-glucose	85.69 ± 2.45
diosgenin + UDP-galactose	0
diosgenin + UDP-rhamnose	0
diosgenin + UDP-xylose	0

rDzS3GT对薯蓣皂苷活性的最适温度和pH

使用薯蓣皂苷和UDP-葡萄糖作为底物，在pH范围为4–8.5内测定酶活性。rDzS3GT的最适pH为6.5（图5a）。当pH为8.0时，rDzS3GT活性几乎不可检测。rDzS3GT的活性在4至90°C的不同温度下测定，最大活性在50°C时观察到（图5b）。当温度达到80°C时，rDzS3GT的活性几乎不可检测。

rDzS3GT催化活性的最适pH（a）和温度（b） 酶活性测定使用薯蓣皂苷和UDP-葡萄糖作为底物进行。所有数据均表示为均值 ± 标准差（SD）。

金属离子对rDzS3GT活性的影响

通过在反应混合物中加入5 mM的金属离子，以薯蓣皂苷为底物，检测各种金属离子对rDzS3GT活性的影响。如表2所示，rDzS3GT活性受到Fe²⁺和Cu²⁺的强烈抑制，并被Ca²⁺、Zn²⁺和Mg²⁺部分抑制。K⁺、Na⁺或Mn²⁺对酶活性没有显著影响。

Table 2 Effect of various ion metals on rDzS3GT activity

Inhibitor	Relative activity remaining(%)
Control rxn	100
KCl	99
NaCl	98
MnCl2	86
CaCl2	64
ZnCl2	60
MgSO4	45
FeCl3	5
CuSO4	2

DzS3GT亚细胞定位分析

为了确定DzS3GT的亚细胞定位，将其与RFP融合。构建了两个由Ubi启动子驱动的植物表达载体：RFP-DzS3GT和DzS3GT-RFP。激光扫描共聚焦显微镜显示，DzS3GT蛋白主要定位于水稻原生质体的细胞质中，与细胞质标记pGOM1的亚细胞定位一致（图6）。使用抗GFP抗体的蛋白质印迹分析也显示该融合蛋白在水稻原生质体中表达。DzS3GT的亚细胞定位可能为皂苷元的糖基化和运输途径在细胞层面上提供新的见解。

DzS3GT-RFP和RFP-DzS3GT的亚细胞定位及蛋白质印迹分析 在水稻原生质体中观察DzS3GT-RFP（a–c）和RFP-DzS3GT（d–f）融合蛋白的亚细胞定位。显示了荧光RFP信号（a, d）、标记（b, e）和合并图像（c, f）。合并图像中的标尺代表2 μm。

盾叶薯蓣中DzS3GT的表达、DzS3GT活性及皂苷积累

通过qRT-PCR获得了盾叶薯蓣不同组织中DzS3GT的表达谱。如图7a所示，DzS3GT在成熟叶中的表达量最高，其次是中叶和幼叶。无论年龄，茎和块茎中的表达水平都较低。此外，与其他器官相比，叶片中的DzS3GT活性和特灵苷含量均最高（图7b, 8）。这表明DzS3GT酶主要在叶片中活跃。值得注意的是，尽管块茎中的皂苷总含量高于叶片，但块茎和茎中几乎检测不到薯蓣皂苷或特灵苷的积累（图8）。此外，从盾叶薯蓣的早期生长期到后期生长期，DzS3GT活性和特灵苷积累均持续增加（补充图S5），这表明DzS3GT活性与盾叶薯蓣叶片中特灵苷含量呈正相关关系。我们推测特灵苷可能会进一步糖基化，转化为其他水溶性更好的皂苷，以便于在植物中运输或储存。

盾叶薯蓣中DzS3GT的表达和DzS3GT活性 a DzS3GT在不同组织中的相对表达量。 b DzS3GT在不同组织中的活性。DUL表示低于定量检测限。

盾叶薯蓣不同组织中的皂苷积累 在幼茎、老茎和老块茎中，特灵苷含量DUL。在幼茎、老茎、幼块茎和老块茎中，薯蓣皂苷含量DUL。DUL表示低于定量检测限。所有数据均表示为均值 ± 标准差（SD）。

讨论

薯蓣属植物积累大量类固醇皂苷，这些皂苷源自皂苷元，但其SGT（糖基转移酶）尚未被充分表征。在本研究中，我们从盾叶薯蓣中鉴定了DzS3GT基因，并将其生化活性与其他植物物种的SGT进行了比较。预测DzS3GT不含N-糖基化位点，而大多数已报道的SGT含有N-糖基化和O-糖基化位点。我们将DzS3GT与其他已报道的SGT进行了系统发育比较（图S6），数据显示DzS3GT属于主要转移葡萄糖基的酶家族，催化薯蓣皂苷在C-3羟基位点的糖基化。已有研究表明，甾醇的3β-OH基团是与WsSGTL蛋白相互作用的主要活性官能团 (Pandey等，2015)。本研究中，基于DzS3GT和薯蓣皂苷的底物对接模型预测氨基酸Asp-144与薯蓣皂苷3-OH位置形成氢键。Asp-144在GTB家族中并不保守，可能是DzS3GT酶的独特特征。

DzS3GT的预测分子量为62 kDa，比从大肠杆菌中纯化的重组DzS3GT蛋白（70 kDa）稍低，这可能是由于rDzS3GT蛋白的O-糖基化和磷酸化造成的。通过HPLC和LC-MS分析测定了rDzS3GT活性，结果表明rDzS3GT将葡萄糖基从UDP-葡萄糖转移到薯蓣皂苷的3-OH位置。植物中的GTs通常以多基因家族存在，通常能够对多种植物小分子进行糖基化 (Jones和Vogt 2001; Lairson等，2008)。rDzS3GT不仅可以糖基化薯蓣皂苷，还可以在体外糖基化胆固醇和β-谷甾醇。相比之下，已表达的rWsSGTL1在胆固醇底物下无活性 (Sharma等，2007)。rDzS3GT的最优酶活性在50°C和pH 6.5下获得，高于Micromonospora rhodorangea来源的真核SGT蛋白的30°C最优温度和pH 6.5 (Huu等，2016)，这可能与SGT蛋白的不同翻译后修饰有关。rDzS3GT的最优pH值略偏酸性，接近中性，与报道的rGsSGT相似 (Tiwari等，2014)。

植物中的类固醇皂苷通常储存在液泡中，以防止自毒 (Sirikantaramas等，2008; Zhao等，2013)。本研究发现DzS3GT主要存在于细胞质中，与其他细胞区室中的类固醇皂苷分离，这不同于先前报道的位于质膜、高尔基小泡、内质网膜和液泡膜的SGTs (Li等，2014; Ullmann等，1987; Warnecke等，1997)，这些SGTs被认为参与细胞壁合成。未糖基化的皂苷元可能在细胞质中糖基化，以便于运输到液泡中，从而避免植物因次生代谢物积累过多而自毒 (Gleadow和Møller 2014; Li和Hu 2009; Zhao等，2013)。因此，DzS3GT可能在维持盾叶薯蓣类固醇化合物代谢的稳定性方面发挥重要作用。

组织表达谱分析显示DzS3GT在各器官中的表达是独立的，这一表达模式明显不同于其他植物物种SGT基因的组织表达谱，如G. sylvestre (Tiwari等，2014)和S. aculeatissimum (Kohara等，2005)。此外，叶片中较高的DzS3GT转录水平和酶活性表明，特灵苷主要在盾叶薯蓣叶片中合成，其他植物器官可能也有助于特灵苷的生物合成。特别是，DzS3GT在成熟叶片中的表达最高，同时这些叶片中薯蓣皂苷的含量也最高。然而，茎和块茎中未检测到薯蓣皂苷。值得注意的是，总皂苷主要积累在块茎中。这些现象表明，薯蓣皂苷可能在叶片中转化为特灵苷，然后进一步糖基化为其他皂苷，便于运输或储存，而块茎可能是皂苷的主要储存部位。许多次生代谢物通常在叶片中合成，并通过茎运输到其他组织 (Yazaki等，2008; Zhao等，2013)，而特灵苷的水溶性不足，可能难以运输或储存 (Cheng等，2012; Ghasemzadeh等，2014)。但这种情况并非绝对，已有研究表明SGT基因表达与S. aculeatissimum中的类固醇化合物aculeatiside A和B的含量没有明显关联 (Kohara等，2005)。然而，仅依靠基因表达、体内DzS3GT活性和皂苷积累数据无法确定这些组织独立合成皂苷的能力，因此需要进一步开展遗传学研究等体内实验以提供更多证据。

综上所述，本研究表明盾叶薯蓣中薯蓣皂苷的糖基化主要发生在叶片中，生成的特灵苷可能进一步糖基化并转化为其他皂苷，以便于向其他组织运输。此外，DzSGT的亚细胞定位可能有助于在细胞层面上确定皂苷元的糖基化和运输途径。本研究为进一步研究薯蓣属植物中SGTs的催化机制和类固醇皂苷生物合成提供了基础，以期通过基因工程改善作物。