细胞实验中的对照给药

细胞对照给药

对照实验 (Control experiments) 是在实验中设置比较对象 (对照组) 的一种科学方法，进行对照实验可评估实验条件改变对实验结果产生的影响。设置对照实验可以增强实验的可信度。细胞实验中的对照实验一般可分为空白对照，阳性对照和阴性对照。

■ 空白对照

空白对照 (Blank control) 是指不给予任何处理的对照。在细胞实验中，常用以评价及观察细胞是否处于正常状态。

如在 The role of ferroptosis in ionizing radiation-induced cell death and tumor suppression 一文中，观察到 H460、A549 和 H1299 细胞系在没有任何处理的情况下，脂质过氧化水平没有任何变化，而暴露于 6 Gy IR 24 小时后，脂质过氧化相对水平升高。

图 1. 电离辐射诱导癌细胞中的铁死亡[1]

■ 阳性对照

阳性对照 (Positive control) 是指按照当前实验方案一定能得到阳性结果的对照实验。因此，阳性对照具有质控的意义。另一方面，阳性对照还可以证明试验药和对照药之间的差别：优效性或等效性。

例如，为了研究 H. richardsonii 提取物 PP-360A 对癌细胞的有丝分裂的影响，研究者选用诺考达唑，紫杉醇作为阳性对照，这两种药物可以诱导有丝分裂停滞。阳性对照组表明：PP-360A 可以有效地诱导由有丝分裂停滞引起的细胞形态改变。如图 2A 所示，三种细胞系 (HT-29、M059K、WI-38) 用 PP-360A 处理后的细胞形态变圆，与诺考达唑处理组类似。免疫荧光染色结果 (图 2B) 显示细胞用 PP-360A 处理后，磷酸组蛋白 H3 (PH3) 和微管蛋白阳性细胞比率升高。

图 2. A: 用诺考达唑 (Noco) 或不同浓度 PP-360A 处理的人类癌细胞形态；B: 用诺考达唑等以及 PP-360A 处理 HT-29 细胞的免疫荧光染色[2]

■ 阴性对照

阴性对照 (Negative control)，和阳性对照相反，是指按照当前的实验方案一定不会得到阳性结果的对照实验。

溶剂对照 (Vehicle control) 是最常见的阴性对照，一些化合物水溶性不好的化合物，需要用有机溶剂 DMSO、乙醇等配制储备液。如果溶剂在最终给药体系中占比较高，可能会对细胞本身状态有较大影响，这时，就会出现这样一个疑问：是药物的作用还是溶剂的毒性导致呢？

在鉴定具有抗黑色素瘤活性的柠檬苦素类天然产物的研究中，DMSO 溶剂对照组的设置很好地证明了 Haperforin G 在 MELHO 中诱导 G1 细胞周期阻滞和增殖停滞。

图 3. Haperforin G 对黑色素瘤细胞增殖和细胞周期的影响[4]

除此之外，在 siRNA 转染，腺病毒转染等实验过程中，常会出现 NC siRNA，NC shRNA 等阴性对照。如在 CYP27A1-dependent anti-melanoma activity of limonoid natural products targets mitochondrial metabolism 一文中，Harpernoid D 的抗黑色素瘤活性依赖于 CYP27A1 (图 4A)。为了研究 CYP27A1 表达与化合物敏感性的相关性，利用 siRNA 瞬时下调 CYP27A1 的表达，并且证明 CYP27A1 的瞬时下调可使细胞免受 Harpernoid D 介导的细胞增殖抑制 (图 4B)。

图 4. 细胞用 NC siRNA 或 CYP27A1 siRNA 转染处理 24 小时[4]

在一些涉及免疫学的实验时，往往需要用到同型抗体设置同型对照 (Isotype control)，同型抗体是指和实验组具有同源性和相同抗体类别的非特异抗体，如图 5 所示，同型对照可以很好的证实实验组抗体的特异性。

图 5. MITF 与黑素瘤细胞系中内源性 CYP27A1 启动子区域的结合[5]

小对照，大学问。一个科学系统的实验设计中必然少不了对照的身影。对照不仅能帮我们佐证实验结果的可靠性，也能在实验失败时帮助我们排查导致失败的原因。怎么样，现在你学废了吗？

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参考文献

1. Callaway E. DeepMind's AI for protein structure is coming to the masses[J]. Nature, 2021.

2. Jumper J, Evans R, Pritzel A, et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold[J]. Nature, 2021:1-11.

3. Baek M, Dimaio F, Anishchenko I, et al. Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network [J]. Science.

4. Hyelim Cho, Qiong Shen, Lydia H Zhang, Mikiko Okumura, Akinori Kawakami, et al. CYP27A1-dependent anti-melanoma activity of limonoid natural products targets mitochondrial metabolism. Cell Chem Biol. 2021 Mar 30;S2451-9456(21)00143-4.

5. JIrwin J J, Tang K G, Young J, et al. ZINC20-A Free Ultralarge-Scale Chemical Database for Ligand Discovery [J]. Journal of Chemical Information and Modeling, 2020, 60, 12, 6065–6073.