融合基因组序列识别scATAC-seq的细胞类型

利用scATAC-seq技术进行单细胞分析，可以在单细胞分辨率下深入了解基因调控和表观遗传异质性，但由于数据的高维性和极端稀疏性，scATAC-seq的细胞注释仍然具有挑战性。现有的细胞注释方法大多集中在细胞峰矩阵上，没有充分利用潜在的基因组序列。因此，SANGO通过整合scATAC数据中可及性峰周围的基因组序列来进行精确的单细胞注释。将峰的基因组序列编码成低维嵌入，然后通过全连通网络重建细胞的峰统计。将学习到的权重作为表示细胞的调控模式，并通过Graph Transformer将查询细胞与参考数据中标注的细胞对齐。

在55个scATAC-seq数据集上，SANGO在样本、平台和组织上的表现始终优于比较方法。SANGO还被证明能够通过Graph Transformer检测未知的肿瘤细胞。此外，通过基因表达富集分析、顺式调控染色质相互作用分析和基序富集分析，作者从注释细胞中发现了细胞类型特异性峰，这些峰提供了功能见解（生物信号）。

来自：Deciphering cell types by integrating scATAC-seq data with genome sequences

背景概述

scATAC-seq为许多生物学应用提供了巨大的机会，包括检测细胞异质性和调控元件，重建分化轨迹和鉴定复杂疾病的生物学机制。scATAC-seq数据分析中最基本的问题之一是细胞类型鉴定，这对于理解复杂组织的组成和发现未知的细胞类型至关重要。目前，一种流行的策略是将细胞聚类，然后通过与特征基因对应的峰对细胞簇进行注释。这一过程繁琐而复杂，涉及专业专家。随着具有良好特征的公共scATAC-seq数据集的迅速增加，利用标记良好的细胞对新生成的数据集进行自动标注是有希望的。

由于scATAC数据固有地涉及可访问峰的高维性和每个细胞reads的稀疏性，因此已经开发了许多方法将scATAC-seq数据转换为合成的scRNA-seq数据，方法是估计“基因活性矩阵”，这些转换后的数据类似于scRNA-seq数据，并通过scRNA-seq注释工具进行处理。考虑到scRNA-seq数据与合成scRNA-seq数据的不同，一些方法已经通过神经网络专门针对scRNA-seq数据进行了优化。然而，这些方法只是简单地总结了基因周围峰的数量，从而忽略了峰的特异性。

为了解决这个问题，有一些方法直接使用逐细胞矩阵数据来注释细胞类型。例如，EpiAnno保留频繁的峰值，并将其输入到非线性贝叶斯神经网络中以捕获潜在空间。scATAnno强调通过估计不确定性分数来检测参考数据中不存在的未知细胞类型。虽然成功了，但这两种方法独立地考虑这些峰，而不考虑它们的相对位置。更重要的是，他们没有考虑基因组序列信息。

事实上，scATAC-seq数据中的峰值可以通过包含细胞类型特异性增强子的可及性和转录因子结合基序的潜在基因组序列来区分，这些基序可以提供有关发育状态和细胞身份的信息。基因组序列信息已被广泛用于预测基因表达、预测染色质可及性、提取embedding和预测增强子-启动子相互作用。然而，基因组信息尚未用于scATAC数据的细胞注释。

为此，作者提出了SANGO，这是一种精确且可扩展的基于图的方法，通过整合DNA序列信息来注释scATAC-seq数据中的细胞。SANGO首先通过通道注意力卷积神经网络(CA-CNN)从底层峰值的DNA序列信息中学习scATAC数据的低维信息表示。学习到的参考和查询数据的低维表示随后被输入到graph transformer中，通过在相似的细胞之间传播共享消息来消除批次效应。最后，通过参考数据中的细胞标签对graph transformer进行微调，并用于预测查询的细胞类型。研究证明，在55个scATAC-seq数据集上，SANGO在跨样本、跨平台和跨组织上的预测表现始终优于比较方法。它还被证明能够检测未知的肿瘤细胞。此外，从注释的细胞中，细胞类型特异性峰可用于下游分析，以提供功能见解。

结果

SANGO的概述

如图1所示，SANGO是一种基于深度学习的方法，用于注释scATAC-seq数据中的细胞。SANGO首先通过预测单细胞染色质可达性，从可达性峰下的DNA序列信息中提取细胞低维表示(阶段1)，然后利用学习到的细胞表示根据参考数据集注释查询数据集的细胞类型(阶段2)。

• 图1：SANGO的架构。SANGO包括序列信息提取和细胞类型预测两个阶段。在第1阶段，在第$i$个峰附近，提取输入的$L$-bp长度的DNA序列，并将其编码为$L\times 4$矩阵（one-hot编码4种碱基）。矩阵经过$C$个卷积滤波器的初始处理，生成维数为$C\times F$的特征矩阵。随后，将该矩阵输入到具有sigmoid和通道方向乘法的通道注意力一维卷积神经网络中。然后是瓶颈层来学习峰的$d$维嵌入。这些嵌入随后被用于预测所有$N_{cell}$细胞的二元可达性，通过一个dense线性网络变换，其权重矩阵$W_c$的大小为$d\times N_{cell}$。阶段1中所有可学习的参数通过所有峰上的二元交叉熵损失进行迭代优化。
• 最后，在dense网络中学习到的权重作为$N_{cell}$细胞的$d$维表示。第二阶段，利用学习到的参考数据和查询数据的表示，通过相似度构建细胞图，并利用graph transformer去除批效应，根据参考数据中$N_{rcell}$细胞的真值标签$Y$和预测的细胞标签$\hat{Y}$。然后，训练后的graph transformer用于预测查询数据集上的标签。

细胞类型注释性能

数据集内部的注释
SANGO首先在14个intra-data上进行评估，每个数据集包含有注释的细胞类型作为参考数据，未注释的细胞类型作为查询数据。

跨平台和跨组织的注释
由于可用的参考数据集主要来自其他平台或组织，因此有必要评估跨平台和组织数据集的方法。在这里，作者首先比较了来自不同测序平台（10x Genomics, snATAC-seq和sciATAC-seq)的数据集，实验使用了19个配对的跨平台和组织的数据集，结果见图3a。

• 图3a：跨平台和跨组织的注释比较。

额外的，实验比较了更广泛的跨组织场景，对于跨7个组织(骨髓、肝、肾、肺、心、肠和小鼠脑)的22个跨组织数据集，见图3c。

• 图3c：更广泛的跨组织注释。

上面实验没有跨物种，都是鼠类上的注释。

数据集说明
数据集 BoneMarrowA、BoneMarrowB、LungA、LungB、Kidney、Liver、Heart、LargeIntestineA、LargeIntestineB、SmallIntestine、WholeBrainA、WholeBrainB、Cerebellum 和 PreFrontalCortex 源自成年小鼠图谱数据，这些数据集使用 sciATAC-seq 技术进行测序。

前部数据集（MosA1，MosA2），中间数据集（MosM1，MosM2）和后部数据集（MosP1，MosP2）来自小鼠大脑次级运动皮层的不同部分，这些数据集使用 snATAC-seq 技术进行测序。

Mouse Brain (10x) dataset和normal cortex dataset使用10x进行测序。

更多其他数据集参考：https://www.nature.com/articles/s43588-024-00622-7#data-availability

多参考-单查询的注释
为了评估SANGO在多源数据或图谱数据上的价值，作者采用了来自小鼠组织的多源数据集(由四个数据集组成)和肠道(由三个数据集组成)组成多源数据集。对于每个源，作者迭代地使用一个数据集作为查询数据，其余数据集作为多源参考数据，得到七个成对的多参考-单查询数据集。注释结果见图4a：

• 图4a：多源参考注释。

另外，可以用标记基因周围的峰值信号来验证SANGO的注释，比如图4d：

• 图4d：预测Memory B细胞和Naive B细胞中重要或高表达基因的染色质可及性coverage plots：Naive细胞为TCL1A，Memory B细胞为FCGR2B和TEX9。每个子图中的术语“region”表示染色体的一个基因组区域。

注释的Naive B细胞在报道的标记基因TCL1A上显示富集峰，而注释的Memory B细胞在标记基因FCGR2B和特异性表达的TEX9基因上显示富集峰。

揭示正常组织的生物学意义

为了证明SANGO的生物学机制揭示能力，作者用前额叶皮层作为参考数据来注释来自成年小鼠大脑的正常皮层数据。由于查询数据没有提供标签，作者首先通过coverage plot检查了预测细胞类型中特征基因的染色质可及性。如图5a所示，对于每种细胞类型特异性基因的基因组区域±3千碱基的峰值信号，scATAC-seq谱中的表观遗传特征在SANGO预测的细胞类型中表现出明显的峰值富集。这些标记基因丰富的表观遗传特征支持SANGO预测的细胞类型注释。

• 图5a：特征基因对应的峰表达。

为了研究预测细胞群的功能见解，作者从三个方面分析了细胞类型特异性峰。首先，通过Signac进行的基序富集分析结果显示，大多数基序是被注释的细胞类型所特有的。其中，兴奋性神经元细胞类型获得了最高的值，达到82%(在前50个基序中有41个细胞类型特异性基序)，内皮细胞类型获得了最低的值，只有52%的细胞类型特异性基序。前10个细胞类型特异性基序在相应的细胞类型中富集(补充图14b)。

• 补充图14b：每种细胞类型的前10个重要motifs。

如图5b所示，每种细胞类型的结合基序也得到了先前文献的支持。现有文献已经有结论：兴奋性神经元细胞(Ex.neurons)被发现富含TBX20、NEUROG2和NEUROD1。发现小胶质细胞富含ETV6、ELF3和SPIB。发现少突胶质细胞富含Sox6、Sox3和SOX13。

• 图5b：过度表达的DNA基序分别通过兴奋性神经元（excitatory neurons）、小胶质细胞（microglia）和少突胶质细胞（oligodendrocytes）的细胞类型特异性可及性峰来鉴定。

其次，通过SNPsea分析细胞类型特异性峰组和背景峰组中的单核苷酸多态性(SNPs)，计算组织特异性表达富集。背景峰是通过从完整峰中省略这些细胞类型特异性峰的结合而得到的。分析量化了79个组织中组织特异性表达谱的富集程度，揭示了前30个兴奋性神经元显著富集的组织，如图5c所示，发现更多和脑组织相关：

• 图5c：在SNPsea分析中，考虑SANGO识别的兴奋性神经元特异性峰和背景峰，确定了前30个表现出大量富集的组织。

最后，SANGO可以揭示特定于细胞类型的可共同访问的位点。通过Cicero预测顺式调节染色质相互作用(图5d)，观察到每种细胞类型特有的顺式调节相互作用。值得注意的是，细胞类型特异性峰(青色峰)与细胞类型特异性相互作用的模式很好地对齐，有效地减少了缺乏细胞类型特异性相互作用的基因组区域的假阳性鉴定。这些结果突出了这些细胞类型特异性峰在破译顺式调控规则和相互作用方面的潜力。

• 图5d：Cicero利用来自兴奋性神经元细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞的scATAC-seq数据来预测顺式调节染色质相互作用。由SANGO识别的细胞类型特异性峰以青色突出显示。

肿瘤微环境中的多水平细胞类型识别

为了研究SANGO在多水平细胞类型预测中的能力，作者在肿瘤微环境中对由不同免疫亚型细胞和肿瘤细胞组成的样本数据进行了评估。通过参考具有合并免疫细胞类型的健康成人大图谱(HHLA)进行注释。

如图6a-c所示，SANGO将肿瘤细胞识别为“未知”。对于已知的细胞类型，大多数免疫细胞和内皮细胞被正确预测，正如river plot所示(图6d)。相反，成纤维细胞被预测为壁细胞(通常称为周细胞)，可能是由于肿瘤微环境内周细胞和成纤维细胞之间的紧密联系。结果表明，该方法能有效区分肿瘤细胞和免疫细胞，并能识别未知类型的肿瘤细胞。

• 图6a-d：a.细胞按实际的细胞类型着色。b.每个细胞的"unkown"概率分数的UMAP可视化。c为SANGO预测的细胞类型。d.由SANGO标注的粗粒度细胞类型(左)映射到实际细胞类型(右)的River plot。

为了测试注释亚型的能力，使用基底细胞癌(BCC-TIL)的肿瘤浸润性淋巴细胞图谱来注释合并的免疫细胞，该图谱包含多种亚型的免疫细胞。SANGO识别免疫亚型的准确率达到90%(图6e,f)。

• 图6e和f：更换参考数据集再注释，可以实现准确的亚型分类。这也是2阶段学习的优势。