R包--ChAMP--甲基化芯片处理（450K、850K）

参考：

1. Yuan Tian&Tiffany J Morris& Amy P Webster&Zhen Yang&Stephan Beck&Andrew Feber& Andrew E Teschendorff. The Chip Analysis Methylation Pipeline. 2021-10-26
2. 生信技能树。 850K甲基化芯片数据分析

 一、450K、850K甲基化芯片覆盖位点

Infinium HumanMethylation450 BeadChip （450K甲基化芯片）覆盖位点

1. （＞450,000 methylation sites）96%的CpG岛；
2. CpG岛以外的CpG位点；
3. 人类干细胞非CpG甲基化位点；
4. 正常组织与肿瘤（多种癌症）组织差异甲基化位点；
5. FANTOM 4 启动子；
6. DNase hypersensitive sites；
7. Human Methylation27 BeadChip中90%的位点

Infinium HumanMethylation850 BeadChip850K芯片包含以下位点：

1. CpG岛以外的CpG位点；
2. 人类干细胞中鉴定到的非CpG甲基化位点 （CHH位点）；
3. 在正常样本VS肿瘤样本（多种类型肿瘤）以及不 同类型组织中鉴定到的差异甲基化位点；
4. FANTOM5项目鉴定到的增强子区域；
5. ENCODE项目开放染色质和增强子区域；
6. DNase超敏位点；
7. miRNA启动子区域；
8. 原450K芯片＞90%的位点 

二、ChAMP介绍

       ChAMP是一个功能异常强大的R包，包括了从甲基化芯片原始数据预处理、标准化到差异的识别等全面的功能。（甲基化数据处理的流水线） 2016年作者对该包进行了更新，新增功能包括细胞类型异质性纠正，差异甲基化块分析，基因集富集分析，功能表观模块分析以及基于图形用户界面的作图。2021年作者再次进行了更新，并且作者也表明他们将不断对ChAMP进行更新。 

ChAMP流程图概述了ChAMP可执行的步骤。每个步骤都可以作为单独的功能单独运行，也可以通过一个操作一步完成。在上面的流程图中，包含了ChAMP 的所有功能，使用蓝红黄三种颜色进行分类：

1. 蓝色函数代表甲基化数据准备的函数，如加载、标准化、质量控制检查等。
2. 红色函数代表生成分析结果的函数，如差异甲基化位置 (DMP)、差异甲基化区域 (DMR)、差异甲基化块、EpiMod（一种检测源自 FEM 包的差异甲基化基因模块的方法，目前不可用）、通路富集结果等等。
3. 黄色函数代表数据集和分析结果的GUI界面。
4. 上图中的灰色实线代表一般流程，而灰色虚线代表可能不一定使用函数，这取决于你的数据和项目。

在上图中，有一些函数和连接（线）标有绿色阴影，表示主分析步骤。ChAMP 结合了许多功能，但也不是所有功能都可以用于成功的分析。绿光代表最有可能用于各种数据集的主要分析步骤。图中间的黑点代表完全准备好的甲基化数据集，这是数据准备和数据分析之间的重要步骤。因此，建议保存完全准备好的数据，后续分析可以直接利用这一数据。

三、安装及使用

1、安装

//先安装BiocManager
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
    install.packages("BiocManager")
//利用BiocManager安装ChAMP包
BiocManager::install("ChAMP")

  安装成功会出现如下的代码

如果出现报错，请参照《富集分析--R包--clusterProfiler下载安装与报错分析解决》解决：富集分析--R包--clusterProfiler下载安装与报错分析解决_Tian問的博客-CSDN博客

2、使用

(1)加载数据

ChAMP包的数据读入十分复杂。450K和850K甲基化芯片的原始数据都是.idat格式, 因为数组是用两种不同的颜色来测量的，所以每个样本都有两个文件，通常是扩展名Grn.idat和Red.idat。数据在载入时还需要一个SampleSheet.csv文件（也称做pd file）, 这个文件很重要，它包含了样本的信息，可以对照测试数据的csv文件和自己的csv文件，对信息不全的地方进行补充。尤其要注意SampleGroup 这一列信息是否有，这一列信息代表你想比较的表型类型，例如疾病和正常。csv文件准备好后，将csv文件与所有样本的芯片数据（即IDAT文件）放在一个文件下，然后就可以正常读入了。 

//450K芯片
data <- champ.load(directory = "F:/data",arraytype="450K")
//850K芯片
data <- champ.load(directory = "F:/data", arraytype = "EPIC")

 champ.load()包含了champ.import()和champ.filter()函数，在读入数据的过程中自动过滤

1. 过滤器用于检测 p 值（默认 > 0.01）的探针。这利用了存储在 .idat 文件中的检测 p 值。 champ.import() 会读取这些信息并将它们组成数据框。对于p 值大于 0.01的探针，则将其过滤掉。 sample和probe的阈值可以分别通过参数SampleCutoff 和ProbeCutoff 来控制。
2. ChAMP 将在每个探针至少5%的样本中过滤掉小于3个beads的探针。可以使用 filterBeads 参数更改此默认值，也可以使用 beadCutoff 参数调整频率。
3. ChAMP 将默认过滤掉数据集中包含的所有非 CpG 探针。
4. 默认情况下，ChAMP 将过滤所有与 SNP 相关的探针。 SNP列表来自Zhou在2016年的Nucleic Acids Research论文。注意，如果你知道你的数据来自哪个人群，你可以选择某些人群进行过滤。否则 ChAMP 会使用 Zhou 提供的 General Recommendation Probes 进行过滤。您只需要分配“population”参数即可实现此目的。
5. 默认设置，ChAMP 会过滤所有的 multi-hit 探针。多重命中探针列表来自2013年的 Nordlund’s Genome Biology Paper。
6. ChAMP 将过滤掉所有位于染色体 X 和 Y 的探针。这也是默认设置，但用户可以通过 filterXY 参数更改它。

(2)质量控制和数据标准化 

质量控制

 ChAMP提供了函数 CpG.GUI() 供用户检查数据在染色体、CpG 岛、TSS 区域上的 CpG 分布。

CpG.GUI(CpG=rownames(data$beta),arraytype="EPIC")

质量控制是确保数据集适合下游分析的重要过程。 champ.QC() 和 QC.GUI() 会绘制一些图表供用户轻松检查其数据质量。

champ.QC() 通常会生成三个图：

champ.QC(beta = data$beta,
         pheno=data$pd$Sample_Group,
         mdsPlot=TRUE,
         densityPlot=TRUE,
         dendrogram=TRUE,
         PDFplot=TRUE,
         Rplot=TRUE,
         Feature.sel="None",
         resultsDir="./CHAMP_QCimages/")

1. 树状图 ：所有样本的聚类图，可以选择不同的方法来生成。 champ.QC() 函数中有一个参数。 “None”表示样本之间的距离将由所有探针直接计算，“SVD”表示champ.QC()函数将使用SVD方法在betas矩阵上进行解卷积，然后从“isva”包中基于EstDimRMT()方法选择beads。再根据这些组件计算样本之间的距离。Feature.sel=”None”
2. 密度图：每个样本的betas分布；可以使用此图来查找与其他样品明显不同且质量可能不佳的样品（例如亚硫酸氢盐转化不完全），还用于识别和确认甲基化或未甲基化的对照样品。
3. MDSPlot（多维标度图）：该图允许基于所有样品中前1000个最易变化的探针来可视化样品的相似性。

QC.GUI() 会生成五个图：

QC.GUI(beta=data$beta,
      pheno=data$pd$Sample_Group,
      arraytype="EPIC")

 MDSPlot、I&II 型密度图、样本 Beta 分布图、树状图和前 1000 个变化最大的 CpG 热图。 通过这些图判断样品是否符合进一步分析的条件，并检查聚类结果和排名靠前CpG。

1. Probe-Type-I&II图：数据集中 Type-I 和 Type-II 探针的 Beta 分布，可以帮助您检查数据集的归一化状态。
2. 前 1000个变化最大的CpG热图：此热图将选择大多数可变 CpG，并根据这些位点的甲基化值创建热图。
3. 其他张

标准化：champ.norm有四种方法标准化：BMIQ, SWAN1, PBC2、 FunctionalNormliazation4。默认的方法是BMIQ, 其中对于850芯片数据，KBMIQ的标准化方法更好。

data_norm <- champ.norm(beta=data$beta,
                        rgSet=data$rgSet,
                        mset=data$mset,
                        resultsDir="./CHAMP_Normalization/",
                        method="BMIQ",
                        plotBMIQ=FALSE,
                        arraytype="EPIC",
                        cores=3)

SVD(singular value decomposition) 用于评估数据集中变量的主要成分。这种成分可能确实是你感兴趣的生物因素，也可能是技术来源的一些变量成分（称为批次效应）。如果 SVD 分析表明技术因素占变异的很大一部分（批次效应），则有必要实施其他标准化方法（例如 ComBat），消除这种技术变异。 ComBat 包含在 ChAMP 管道中，以消除与珠片、位置和/或板相关的变化，也可用于消除 SVD 分析中显示的其他批次效应。

champ.SVD(beta = data_norm,
          rgSet=NULL,
          pd=data$pd,
          RGEffect=FALSE,
          PDFplot=TRUE,
          Rplot=TRUE,
          resultsDir="./CHAMP_SVDimages/")
#Combat校正
data_Combat <- champ.runCombat(beta=data_norm,pd=data$pd,batchname=c("Slide"))

 

（3）差异识别

完成质量控制和数据标准化等步骤后，对保存的数据进行流程图提供的函数进行差异甲基化探针champ.DMP、差异甲基化区域champ.DMR、差异甲基化模块champ.Block 及相应的可视化。

（4）其他

ChAMP包还可以进行基因集富集分析champ.GSEA、拷贝数变异champ.CNA、细胞类型异质性champ.refbase等计算

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感谢您的查看，致谢！(｀･ω･´)ゞ(｀･ω･´)ゞ

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