基于参考注释的RNA-seq分析

Step 1 –构建参考序列索引：

$ mkdirbti# 在stuXX目录下新建文件夹

$ cd bti

$ ln -s /database/peixun2015/ref/ath.fa# 在当前目录，建立参考序列文件的超链接

$ bowtie2-build ath.faath# 为参考序列建立索引

 

Step 2 –比对基因组：

$ mkdiralign # 在stuXX目录下新建文件夹

$ cd align # 进入align 目录操作

$ tophat2 # 空运行tophat2, 了解软件用法

$ tophat2 --output-dirc1 -g1 -r0 --mate-std-dev0 -G/database/peixun2015/ref/ath.gtf--no-coverage-search/database/peixun2015/ref/ath/database/peixun2015/fastq/SRR1307153.fq

(/database/peixun2015/test/rnaseq/align/align.sh)

 

 

Step2–结果：

prep_reads.info

unmapped.bam

align_summary.txt

insertions.bed

deletions.bed

junctions.bed

logs/

accepted_hits.bam

 

Step2–查看bam：

$ samtools# 空运行, 了解软件用法

$ samtoolsview accepted_hits.bam| less –SN

# -SN 单行显示，并显示行号。

 

例子：

$ cd c1 #进入c1样本结果的文件夹

$ ls# 在里面找到比对结果，bam格式

$samtoolsview accepted_hits.bam| -SN

 

Step 3 –计算差异表达：

$ mkdirdiff #在stuXX目录下新建文件夹diff

$ cd diff #后续在diff 文件夹中操作

$ cuffdiff# 空运行软件, 了解软件用法

$ cuffdiff-oexpr -b/database/peixun2015/ref/ath.fa-p1 --no-diff--dispersion-methodpoisson--library-norm-methodclassic-fpkm-m76 -s1 -Lc1,c2,c3,m1,m2,m3 /database/peixun2015/ref/ath.gtf../align/c1/accepted_hits.bam../align/c2/accepted_hits.bam../align/c3/accepted_hits.bam../align/m1/accepted_hits.bam../align/m2/accepted_hits.bam../align/m3/accepted_hits.bam

 

Step 3 –计算差异表达：

# 依然在diff文件夹中操作；

$cuffdiff-ode-b/database/peixun2015/ref/ath.fa-p1 --dispersion-methodpoisson--library-norm-methodclassic-fpkm-m76 -s1 -Lcontrol,mutant/database/peixun2015/ref/ath.gtf../align/c1/accepted_hits.bam,../align/c2/accepted_hits.bam,../align/c3/accepted_hits.bam../align/m1/accepted_hits.bam,../align/m2/accepted_hits.bam,../align/m3/accepted_hits.bam

 

Step 3 –结果：

var_model.info

isoform_exp.diff

tss_group_exp.diff

gene_exp.diff

cds_exp.diff

splicing.diff

promoters.diff

Cds.diff

isoforms.fpkm_tracking

tss_groups.fpkm_tracking

cds.fpkm_tracking

genes.fpkm_tracking

isoforms.count_tracking

tss_groups.count_tracking

cds.count_tracking

genes.count_tracking

isoforms.read_group_tracking

tss_groups.read_group_tracking

cds.read_group_tracking

genes.read_group_tracking

read_groups.info

run.info

bias_params.info

 

Step 3 –查看差异表达结果：

$ less -SN gene_exp.diff

 

Step 4 –富集分析：

http://david.abcc.ncifcrf.gov/

Step 1:Submit your gene list through left panel (or use Gene ID Conversion Tool firstly)

Step 2：Analyze above gene list with one of DAVID tools

Functional_Categories(3 selected)

Gene_Ontology (3 selected)

Pathways（1 selected)——KEGG_PATHWAY

Protein_Domains(3 selected)