绿脓杆菌(铜绿假单胞菌)是一种需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性菌,广泛存在于土壤、水体和医院等环境中,是一种常见的致病菌。绿脓杆菌的培养通常使用液体培养基或固体培养基,通过提供适当的营养物质和条件,促进绿脓杆菌的生长和繁殖。测定绿脓杆菌的方法包括生化试验、分子生物学方法、荧光染色法等。
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用途
绿脓杆菌的培养和测定常用于基础科学研究、医学诊断、食品卫生检测等领域。
材料与仪器
绿脓杆菌菌株、液体培养基、固体培养基、试管、培养皿、生化试剂、荧光染色剂等。
步骤
1、培养基的制备:将适量的营养肉汤培养基(BHI)或大肠杆菌 LB 培养基加入适量的蒸馏水中,混合均匀,然后加热至完全溶解,再进行高压灭菌。
营养肉汤培养基配方:牛肉膏 3.0 g,蛋白胨 10.0 g,NaCl 5.0 g,琼脂 20.0 g(液体培养基不含),蒸馏水 1.0 L,pH 7.0。
2、培养基的接种:在灭菌的培养基中加入所需的抗生素(如果需要),然后用无菌技术将绿脓杆菌接种到培养基中。
3、培养条件的设置:将接种好的培养基置于 37 ℃ 恒温培养箱中,培养 18~24 小时。
4、菌落的观察:观察培养皿中的菌落形态,绿脓杆菌的菌落通常呈现出灰色、绿色或黄绿色,呈不规则形状,边缘模糊,表面光滑或粗糙。
5、细菌涂片的制备:用无菌的铁丝环取一定数量的菌落,涂抹于玻璃片上,然后用火烧杀菌。
6、细菌涂片的染色:采用革兰染色法对细菌涂片进行染色。
① 初染:在菌膜上滴加结晶紫,以盖满菌膜为度,约 1 分钟后,用细水流将染液冲洗。
② 酶染:滴加卢戈氏碘液数滴,约 1 分钟后轻轻冲洗。
③ 脱色:滴加 95% 酒精 3~4 滴,轻轻晃动玻片数秒钟,倾斜玻片弃去酒精,如此反复数次后,流下的酒精几乎无色或稍呈淡紫色,最后冲洗。
④ 复染:滴加稀释复红染液数滴,约 1 分钟后冲洗。
⑤ 染色完毕后,用吸水纸将玻片吸干、干燥处理,滴加香柏油,镜检。
7、细菌的鉴定:根据观察到的菌落形态、细菌涂片的形态以及生化测试的结果等综合判断,确定绿脓杆菌的种类。
8、附录:
1)绿脓杆菌的菌落形态通常具有以下特征:
形状:绿脓杆菌的菌落形状不规则,呈现出分叉、分枝或网状的形态。
颜色:绿脓杆菌的菌落颜色通常呈现出灰色、绿色或黄绿色。
大小:绿脓杆菌的菌落大小通常在 2~3 毫米左右。
边缘:绿脓杆菌的菌落边缘通常模糊不清,呈现出分叉、分枝或网状的形态。
表面:绿脓杆菌的菌落表面通常光滑或粗糙,有时也会呈现出凹凸不平的形态。
2)氧化/还原测试:绿脓杆菌是一种革兰氏阴性杆菌,氧化酶阳性。通过观察氧化还原指示剂的变化,可以确定绿脓杆菌的氧化还原性。
3)酸碱度测试:绿脓杆菌通常是产生酸的,可以通过酸碱指示剂的变化来检测绿脓杆菌的酸碱度。
4)碳水化合物测试:绿脓杆菌通常可以利用葡萄糖和乳糖等碳水化合物进行代谢。可以使用含有这些碳水化合物的培养基来测试绿脓杆菌。
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注意事项
1)绿脓杆菌菌株的选择应根据实验需求和绿脓杆菌的特性进行选择。
2)培养过程中应注意无菌操作,避免杂菌和细菌的污染。
3)培养条件的设置应根据绿脓杆菌菌株的生长特性进行设置,以促进其生长和繁殖。
4)生化试验和分子生物学方法应根据实验设计选择合适的方法和试剂,避免误差。
5)荧光染色法应注意荧光染色剂的浓度和染色时间,避免影响结果的准确性。
6)常见问题包括菌落污染、菌株不纯、生长速率过慢或过快等。
7)操作者注意防护措施,避免自身感染。