简化基因组的测序方法

RAD-Seq(restriction site-associated DNA sequencing)最开始指的是2008年发表在PLOS ONE上“Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers"提出的方法，目前该文章的引用已经达到1200+，现在指代的是一系列基于限制性内切酶的测序技术。同样在概念上被引申的还有GBS(genotyping-by-sequencing),只不过GBS的名字不能让你直接把它和限制性内切酶联想起来.总之，如果现在公司给你推荐GBS或RAD-seq时，可能未必和你想的一样，你需要仔细问下他们的建库手段。毕竟手段不同，你的实验设计，操作和结果都会发生变化。这是RAD-seq相关方法的历年引用情况

不同RAD-seq技术引用情况

RAD-seq虽说方法很多，但是文库构建流程大致如下，不同方法在其中某些步骤存在差异

• 起始基因组DNA量：能否允许降解FNA
• 限制性内切酶酶解：限制酶种类，数量
• 酶切位点结合接头：接头类型
• 酶解片段大小选择：直接选择，间接选择
• 添加barcode混池：视v接头而异
• 测序类型选择：单端，双端

两者的差异在于，1）是现进行酶切然后随机破碎，最后仅选择存在酶切位点片段测序；2）也是酶切，但是后续直接选择合适大小的片段测序。

因此相对于1）测序的位点平均会少一点，也就会导致同一批样本后者利用率低于前者。无参考基因组更推荐前者，而不是后者。

不同方法的数据利用率

原始RAD-seqs

最先提出的RAD-seq技术流程，也就是RAD-seq的冠名技术，分为如下几步：

1. 基因组DNA用限制性内切酶裂解， 然后连接到P1接头。P1接头里含有正向扩增和Illumina测序引物位点，以及4~5 bp 的核酸barcode. barcode至少大于3 bp。
2. 之后接头连接的片段(adapter-ligated fragments)混池，随机打断
3. DNA随后连接到P2接头，反向扩增扩展引物无法连接P2. P2是一种Y型接头，包含P2反向扩增引物位点的反向互补序列，使得不含P1接头的片段无法扩增。(Y型接头的工作原理)
4. 最后仅有同时含P1和P2接头的片段能够上机测序。

RAD-seq protocol

Genotyping-by-Sequencing

GBS比原始的RAD-seq步骤更加简单

1. 将不同样本和含不同barcode接头成对放在平板里
2. 使用ApeKI限制酶进行酶解
3. 使用T4连接酶，将接头连接到片段两端因酶切产生的粘末端（stcky end）
4. 将含不同barcode的样本混池，随后过片段长度筛选柱，过滤尚未反应的接头
5. 加入PCR引物，进行PCR扩增

这里没有直接对片段进行筛选，但是PCR扩增时优先扩增小片段

Genotyping-by-Sequencing流程

ddRAD-seq

ddRAD-seq和GBS相似，两者都不需要在加接头后进行随机打碎，GBS通过PCR扩增的方式过滤了大片段，而ddRAD-seq通过双酶切的方式，然后筛选固定长度来选择合适大小的片段

ddRAD-seq和RAD-seq的不同

常见方法的比较

其实这些RAD-seq文库制备方法可以简单的分为两类：

• 1）对单酶切位点邻近片段测序，如最初的RAD-seq
• 2）对酶切位点两翼片段测序，如Genoytping-by-Sequencing

下面是常见的物RAD-seq方法比较

方法	原始RAD	2bRAD	GBS	ddRAD	ezRAD
控制位点的方法	选择限制酶	选择限制酶	选择限制酶	选择限制酶和片段大小选择阈值	选择限制酶和片段大小选择阈值
位点数/Mb	30～500	50～1000	5～40	0.3～200	10～800
位点长度	300bp 或1kb contig	33–36 bp	< 300 bp	< 300 bp	<300 bp
barcode费用/样本	低	低	低	低	高
添加barcode难度/样本	中等	低	低	低	高
是否用到专利试剂盒	否	否	否	否	是
识别PCR重复	使用双端测序	不能	使用降解的barcode	用降解的barcode	不能
特殊的设备	超声破碎仪	无	无	Pippin Prep或普通的跑胶仪	Pippin Prep或普通的跑胶仪
是否适用复杂和大基因组	好	差	中等	好	好
是否适用无参考基因组	好	差	中等	中等	中等

参考文献

• RAD-seq: Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers
• GBS: A Robust, Simple Genotyping-by-Sequencing (GBS) Approach for High Diversity Species
• ddRAD-seq: Double Digest RADseq: An Inexpensive Method for De Novo SNP Discovery and Genotyping in Model and Non-Model Species
• 2011 NATURE REVIEWS | GENETICS：Genome-wide genetic marker discovery and genotyping using next-generation
• 2016 NATURE REVIEWS | GENETICS：Harnessing the power of RADseq for ecological and evolutionary genomics