ctab提取dna流程图_逆转录过程中需要DNA聚合酶么？

逆转录过程中需要DNA聚合酶么？

【疑惑背景】(2019学年第二学期名校协作体T29)人血清白蛋白(HSA)在临床上需求量很大，通常从人血液中提取，但提取量有限，因此科学家利用基因工程和胚胎工程等技术培育转 HSA 基因牛，该种牛能生产含 HSA 的牛乳，下图是培育流程图，据图回答下列问题：

图中过程①需要用______酶最终得到双链 DNA 分子；该 DNA 分子往往需要经过 PCR 扩增。

答案：逆转录酶和DNA聚合酶(答全给分)

【疑难纠结】在逆转录酶参与的逆转录过程中最终不能合成DNA么？

【疑难解析】

逆转录病毒：该类病毒首先以自身RNA模板，经逆转录酶的催化，形成RNA-DNA杂交分子，再以单链DNA为模板，合成双链DNA，后者整合到宿主细胞的DNA上，进而合成若干个子代单链RNA。其子代RNA和亲本均可充当mRNA翻译各种病毒蛋白质，如HIV病毒，Rous肉瘤病毒等。^[1]

逆转录酶催化的DNA合成反应以4种脱氧核苷三磷酸作为底物，要求有模板和引物，此外还需要适当浓度的二价阳离子(Mg²⁺和Mn²⁺)和还原剂(以保护酶蛋白中的巯基),DNA链的延长方向为5′→3′。这些性质都与DNA聚合酶相类似。当以其自身病毒RNA作为模板时，该酶表现出最大的逆转录活力，但是带有适当引物的任何种类RNA都能作为合成DNA的模板。引物可以是寡聚脱氧核糖核苷酸，也可以是寡聚核糖核苷酸，但必须与模板互补，并且具有游离3′-OH末端，其长度至少要有4个核苷酸。实验室常用该酶合成mRNA的cDNA。

现在知道，逆转录酶是一种多功能酶，它兼有3种酶的活力。①它可以利用RNA作模板，在其上合成出一条互补的DNA链，形成RNA-DNA杂合分子(RNA指导的DNA聚合酶活力)；②它还可以在新合成的DNA链上合成另一条互补DNA链，形成双链DNA分子(DNA指导的DNA聚合酶活力);③除了聚合酶活力外，它尚有核糖核酸酶H的活力，专门水解RNA-DNA杂合分子中的RNA。^[2]

反转录病毒的整个复制过程可以概括为以下几个步骤: 

(1)在细胞膜的特殊受体处通过与 胞膜融合进入细胞。

(2) 在细胞膜上病毒粒子脱去衣壳，基因组和酶类留在核心。(3)反转录。在反转录酶的作用下2条RNA基因组中的一条转变为单链DNA，然后形成线性双链DNA，进入细胞核。(4)整合，反转录的DNA拷贝整合到宿主基因组中。  

(5) 转录，反转录的DNA转录形成病毒mRNA和子代病毒RNA。(6)装配和壳体形成。在细胞质中将基因组RNA装配进核衣壳中。

(7)出芽，病毒粒子在细胞质膜处以出芽方式释放出去。^[3]

反转录酶主要是一种DNA聚合酶，但实际上，它表现出3种酶活性：①以RNA为模板合成DNA(反转录);②以DNA为模板合成DNA;③核糖核酸酶H活性(降解RNA:DNA杂交链中的RNA链)。像所有DNA聚合酶一样，反转录酶在进行DNA合成时也需要引物，这种引物是特异的细胞内转运RNA(tRNA),用作引物的tRNA是从以前的宿主细胞带入病毒粒子的。^[4]  

从中发现：自然的逆转录病毒，可以在逆转录酶的作用下，以RNA为模板逆转录合成DNA。不需要DNA聚合酶的作用。

cDNA的合成。反转录酶能以RNA为模板合成DNA,用oligo(dT)(或随机引物)作引物，合成cDNA的第一链；用碱处理或用RNase H降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA,剩下的cDNA单链的3′端一般形成一个弯回来的双链发夹结构，可作为合成第二条cDNA链的引物，用DNA聚合酶合成第二链DNA。^[5]

cDNA文库的构建：

(1)mRNA的分离

所分离的mRNA应尽量保证其完整性，必须在低温条件下提取RNA，并加入异硫氰酸胍、盐酸、胍、尿素等强变性剂以抑制RNase的活性，但是部分mRNA还是因种种因素而发生断裂，这就需要分离5′端含有帽子结构的mRNA,可以利用与帽子结构蛋白结合的亲和层析实现。poly(A)是绝大多数mRNA具有的特征，再利用oligo(dT)接头序列作为反转录引物合成第一链，可以保证其3′端是完整的。

(2)第一链cDNA的合成    

通过碱性磷酸酶对所提取的mRNA5′端进行脱磷处理，可以使断裂的mRNA5′端变成OH,然后再用脱帽酶去除mRNA分子的5′端帽子部分，其5′端的磷酸可以与人工合成的接头在RNA连接酶的作用下连接，再经逆(反)转录合成cDNA,经PCR扩增可获得第一链全长cDNA。

(3)第二链CDNA的合成    

第二链的合成可以采用PCR方法以模板转换引物与oligo(dT)相连的接头序列扩增获得全长基因cDNA。利用该技术所构建的文库有80%~85%为全长。逆转录酶的性质及逆转录时的温度对获得全长cDNA也十分重要，利用可耐60℃高温的逆转录酶或在逆转录反应中加入一定浓度的海藻糖可以提高其对高温的耐性，同时并不影响其逆转录效率，这样就可以最大限度地减少mRNA在低温中稳定的二级结构对逆转录的空间阻碍。

(4)克隆双链cDNA并导入大肠杆菌中    

将上述经均一化的基因全长cDNA两端加上稀有酶切位点(例如NotI),连接形成线状多聚体，克隆到载体中并导入E.coli中繁殖扩增(图19-8)。^[6]

从中发现：在cDNA文库的构建过程中，需要加入DNA聚合酶进一步来获得DNA片段。

【疑难豁然】自然状况下，逆转录病毒可以在逆转录酶的作用下，以RNA为模板逆转录合成DNA，不需要DNA聚合酶的作用。在人为参与的逆转录过程往往需要加入DNA聚合酶，确保所得DNA的正确性和速度。

所以本题的答案为逆转录酶和DNA聚合酶没有问题。

参考文献

1、张胜 秦磊.高中生物疑点通[M].安徽：中国科学技术大学出版社，121

2、王镜岩 朱圣庚 徐长法.生物化学教程[M].北京：高等教育出版社，590

3、[美] M.T.马迪根 J.M. 马丁克.Brock微生物学[M].北京：科学出版社，366

4、[美] M.T.马迪根 J.M. 马丁克.Brock微生物学[M].北京：科学出版社，770

5、夏启中.基因工程[M].北京：高等教育出版社，138

6、戴灼华 王亚馥 粟翼玟.遗传学[M].北京：高等教育出版社，466

资料来源于网络，仅供教学、学习使用！侵权删！

●精品推荐 ●

● 高中生物教材(电子版)

● 2019新人教版高中生物学必修+选择性必修(电子书)                          

● 新教材网络培训视频和课件(全)

● 人教版《分子与细胞》模块教材部分知识内容修订说明

● 人教版新旧教材对比

● 人教版高中生物学“新旧教材对比”--必修2 遗传与进化

● 高中生物学核心概念

● 高中生物学精美图片集

● 高中生物判断题集锦解析

● 2017--2020年全国高考生物试题及答案详解

● 人教版新旧教材一些概念在叙述上的变化

● 螟蛉有子 蜾蠃负之

● 高中生物知识动画演示

●光合作用过程中水的光解需要酶催化

●高中生物教学中的疑难问题

●高中生物教材中的实验方法与操作

●浅谈高中生物教学中对照实验和对比实验

● 高中生物知识点巧记口诀大全

● 选修三 现代生物科技专题隐性知识

● 例证法解答高中生物选择

● 蝗虫种群密度的调查方法

● 2020高考生物热点专题病毒

● 高中生物常见错别字归纳

●高中生物教材涉及的19种技术方法

●普通高中生物学课程标准修改变化(2020年)

●肺炎双球菌转化实验的疑难问题及解析

●高中生物同位素示踪试题归类分析

●高中生物各题型解题技巧

●中国高考评价体系

●高考生物考前易错点突破

●高中生物的34条谣言和150个误区

●证明符合分离规律的实验

●遗传系谱图的快速判定方法

● 高中生物实验考前复习

● 高中生物:41个特殊的细胞

● 生物常见的性别决定方式

● 高考生物答题规范与技巧

●《必修1 分子与细胞》边角知识

●《必修2 遗传与进化》边角知识

●《必修3 稳态与环境》边角知识

● 高中生物教材边角知识(十二)

● 实验答题模板(验证性实验答题模板)

● 实验答题模板(探究性实验答题模板)

●   实验答题模板(遗传类实验答题模板) ●   实验答题模板(评价和修正类答题模板) ●   高中生物实验基础(一) ●   高中生物实验基础(二) ●   高中生物实验基础(三) ●   高中生物实验基础(四) ●   高中生物实验基础(五) ●   高中生物实验易错点归纳 ●   高中生物教材实验归纳 ●   高中生物学中涉及的经典实验 ●   高中生物实验易错点归纳 ●   高中生物(必修+选修)的科学史 ●   高中生物学实验的各种颜色反应总结 ●   一.实验材料或调查对象的选择 ●   二.高中实验中部分试剂(药品)的作用 ●   三   高中实验中特殊试剂的不同作用 ● 四.实验方法(技术)

● 高中生物《分子与细胞》教材中21个“隐性知识”

● 高中生物《遗传与进化》教材中14个“隐性知识”

● 高中生物《稳态与环境》教材中11个“隐性知识”

● 高中生物教材中37个偏难怪知识点

● 基因在染色体上的位置判断

● 解答遗传题的基本方法

● 高考生物选修一知识点总结

● 高中生物选修三知识点总结

● 解答生物学实验设计的基本思路

● 判断伴性遗传与常染色体遗传的基本方法

● 植物光合作用的测定及不同波长的光对光合作用的影响

● 2019版高中生物(必修+选修)实验课视频