ctab法提取dna流程图_ctab法DNA提取.doc

DNA的提取问题

问：经过近一个周的努力，终于提取出了像样的DNA，不过还不是十分满意，但已经能独立进行实验了，不用再“见人就抓，抓住就问”了，呵呵！记得曾经抓过黄清师兄、梁伟锋师兄、康云师兄、王宝生师兄、杨霞师姐、冬梅、艳艳等，还有一位不知道名字的师兄，当然老公是必定要抓地，嘿嘿！真心感谢他们对我的耐心指导和帮助！没有他们的出手相助，我真的心里没底。邱志敬提DNA提的挺好的，向他学习！

同时，丁香园上不知名的朋友给了我很多的实验技巧，现摘录如下以作学习之用：

我现在所提取的植物基因组DNA均为黄褐色沉淀,参考了一些文献将实验条件做了相应修改,但结果不理想,请问有什么有效的方法可以解决此问题吗?多谢!

答：DNA经离心后沉积在离心管底部时会有一些颜色，大概是很浅的黄褐色，如果蛋白没有抽提干净，就会呈现出白色，所以我觉得你先跑个胶试试，我觉得没有什么问题。

问：谢谢,我提的DNA沉淀颜色较深,有点接近于棕褐色,最后溶解于TE后颜色也很深,不象他们提取的呈透明状,跑琼脂糖凝胶电泳可看到在20kb出有一透亮条带,如果去除这些杂质后不知DNA的量是否会多一点?

答：棕褐色应该是由于多酚类物质氧化所致--可考虑在提取液中添加抗氧化剂和PVP来控制,但对你的DNA量不会有什么影响.多酚类的存在可能会影响你的DNA的限制性酶切效果.

在提取某些植物DNA时总是遇到多糖成分的干扰，尝试了几种方法效果一直不大理想，DNA质量一直不高，哪位高人指点一下如何消除多糖的影响？

不知楼主用的什么方法提取，是SDS法还是CTAB法。一般来说，SDS法提取的DNA会还有较多的多糖，使DNA成胶冻状。而CTAB法提取可基本上除去多糖。如果楼主用的是SDS法，可以考虑改用CTAB法试一试。

如果是植物材料本身含糖量比较高，可用以下方法试一试：

1在DNA未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。如可用缓冲液：100mmol/LTris-HCl(pH=8.0)、5mmol/LEDTA和0.35mol/LSorbitol洗几次。

2使DNA提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入0.35倍体积的无水乙醇，迅速混匀，多糖会先沉淀。

3沉淀DNA时，使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5mol/LNaCl，或加NH4Ac使终浓度为10mmol/L。或0.5mLDNA液中加0.125mL4mol/LNaCl和0.625mL13%PEG8000(冰浴1h)。

4多糖和DNA的共沉淀物进行再分离。如用TE缓冲液反复清洗共沉淀物，将清洗液合并再用醇沉淀DNA，或将沉淀物溶解后，经琼脂糖电泳，切下DNA部分再将胶回收，或者用多糖水解酶将多糖降解。还有在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用而去除多糖。

上述方法还可组合使用，以达到最佳效果。然而这些方法均会在一定程度上减低DNA的提取量；如果材料较少或要求较高，则可考虑用柱层析方法，使用对DNA具有特异性吸附的树脂来纯化DNA。曾有文献提到选用WizardPurificationKit，PRC-5柱，SephacrylS-1000或S-500，QiagenGenomictip500/G，或者CsCl梯度离心纯化DNA。

楼主可根据自己的实验要求试一下以上方法，希望能对你有所帮助，祝成功。

大家帮忙看看我提的DNA能用于后面PCR的模板吗？

我是用CTAB法提取白腐真菌的染色体DNA，提取之后用0.8％琼脂糖电泳图如下(1和10泳道为Marker，23000bp)：

总体感觉长片段的条带不多，小片段的倒是很多，后面我设计了mnp和lip基因的引物准备PCR，请教各位这次提取的DNA质量可以用作PCR的模板吗？

还用一个问题：

电泳图片上加样孔附近的条带是片段很大的DNA吗？还是由于别的操作问题产生的条带？谢谢！

建议从新抽题后再进行PCR，原因如下：

1.从你的图上来看，一是RNA含量太高，建议加RNAase处理，可以在加入CTAB后加入RNAase，这样可以在65度处理时同时去除RNA。

2.你的DNA条带其实是23000bp左右的条带；

3.点样孔附近的条带，其实不是DNA条带，是蛋白污染造成的亮带，不是大片段的DNA。

不知我的回答，能解决你的问题否？

楼上的朋友说得对，而且楼主的DNA不仅是存在杂质，而且还发生了降解。

楼主可再次重新抽提DNA，在抽提时请注意以下几点：

1.研磨样品时要有液