单基因gsea_JTO：日本Smoker基因组综合分析

今天给大家带来的是2020年2月发表在J Thorac Oncol (12.46)杂志上的文章“Identification of Novel CD74-NRG2α Fusion From Comprehensive Profiling of Lung Adenocarcinoma in Japanese Never or Light Smokers”。在这篇文章中作者通过全转录组测序与外显子测序的方法，在日本不或轻度吸烟者LUAD中新型CD74-NRG2α融合蛋白，同时作者还发现日本不或轻度吸烟者LUAD的拷贝数变异与突变特征。作者还构建了一个由3个基因组成的LUAD预后模型。

Identification of Novel CD74-NRG2α Fusion From Comprehensive Profiling of Lung Adenocarcinoma in Japanese Never or Light Smokers

从日本未吸烟者和轻度吸烟者的LUAD综合概况中鉴定新型CD74-NRG2α融合蛋白

以后我们公众号的文献解读尽量都会让小编附上视频讲解，希望大家能够喜欢。btw，虾饺皇小编第一次录制视频，有点小紧张，希望大家理解；我们会越做越好的。

一.研究背景

在全球范围内每年有超过百万人因肺癌死亡，而在肺癌中，最常见的类型为LUAD，目前酪氨酸激酶(RTK)靶向疗法在相应的激酶基因激活的LUAD中效果较好，现在针对KRAS、ERBB2、BRAF、MET、RET、NTRK1和NTRK等基因的靶向疗法的研究也在进行中。

二.分析流程

三.结果解读

1.对不或轻度吸烟者的LUAD进行全转录组测序和全外显子测序发现存在未知的驱动基因

• 图1A：对日本队列996例原位LUAD(373 例重度吸烟、例104 轻度吸烟、 510例不吸烟和9例未知吸烟史)通过PCR clamp 、FISH等方法进行驱动基因检测，其中有435例EGFR突变、121例KRAS突变、 22例ALK融合、10例RET融合和10例ROS1融合。KRAS和G12C在重度吸烟者中占比较大。389Patients上述所有的突变都为阴性，其中有201Patients不或轻度吸烟。
• 图1B：对124例不或轻度吸烟LUAD、1例重度吸烟LUAD(对照)和1例重度吸烟LUSC(对照)进行全转录组测序，发现有26例EGFR罕见突变、16例ERBB2突变、17例BRAF突变、8例MAP2K1突变和3例NRG1融合。对上述124例不或轻度吸烟LUAD中的83例进行全外显子测序，发现13例MET外显子14跳跃( 通过split reads验证了MET外显子13与外显子15连接)；每一例都有EGFR、ERBB2、MET和MAP2K1过表达；和此前未被发现的1例CD74-NRG2融合体和1例FGFR2-MBIP融合体
• 图1C：外显子测序发现的CD74-NRG2融合体，CD74-NRG2的NRG2的转录本变体为NRG2α；EGF基序由NRG2α的外显子4和外显子5编码，被包含在CD74-NRG2α融合物中
• 图1D：NRG1融合的转录变体。外显子En代表NRG1β的下游外显子，外显子TMc为外显子α和外显子En的下游外显子。NRG1融合由NRG1α和NRG1β在内的不同转录变体组成
• 因此，125例LUAD中有88例被鉴定出驱动基因

图1. 发现位置的驱动基因

2.NRG1 / 2-融合阳性LUAD的临床病理特征

• 表1：作者展示了4例NRG1 / 2-融合阳性Patients的Clinical Information，均为60-70岁女性，并进行了手术切除。CD74-NRG2α阳性Patients接受erlotinib(埃罗替尼)治疗并且在停药一个月患有皮疹
• 图1E：展示了NRG1 / 2Patients的组织切片，CD74-NRG2α阳性LUAD的组织分型为腺泡腺癌，由圆形到椭圆形的非典型腺体组成；CD74-NRG1阳性LUAD的组织学分型为浸润性黏液腺癌，由胞浆内具有丰富黏蛋白和基底取向核的柱状细胞组成；SDC4-NRG1阳性为实体腺癌，主要由构成薄片样的多边形Tumor细胞组成。同时，作者对Tumor细胞进行了NRG1融合蛋白下游激活信号p-EGFR和p-HER2/3/4的免疫组化分析，CD74-NRG2α阳性病例中p-HER4呈弱阳性，p-EGFR、p-HER2和p-HER3阴性；NRG1融合阳性病例中所有HER家族阳性。

表1. NRG1 / 2-融合阳性Patients的Clinical Information

3.不或轻度吸烟者LUAD中的突变特征与拷贝数分析

• 图S4AB：使用 Wellcome Trust Sanger Institute Mutational Signature Framework，发现4个COSMIC突变特征与LUAD显著相关
• 图S4C：展示四个突变特征情况在83个外显子测序中的情况
• 图S4D：展示了染色体拷贝数扩增情况，其中chr1q、chr5p(包括TERT基因座)、chr7p(EGFR)、chr8q(MYC)、chr12(MDM2)、chr16p、chr17q(ERBB2)和chr20q扩增，而chr9和chr17拷贝数丢失

图S4. 突变特征与拷贝数变化

4.通过NGS分析检测驱动基因的体细胞突变

• 图S7A：作者发现7个MAP2K1突变的病例情况：p.Glu102_Ile103del和p.P105_A106del
• 图S7B：通过TaqMan单核苷酸多态性基因分型分析该队列其他Patients的MAP2K1突变发现在有两例不或轻度吸烟Patients存在p.P105_A106del，而重度Patients没有

图S7. 检测到MAP2K1突变

• 同时，作者通过在细胞中转染MAP2K1与上述突变体进行细胞学验证
• 图S8A：发现MAP2K1转染无转化的病灶，而突变体转染形成病灶，进一步通过WB验证了突变体能增强激酶活性
• 图S8B：通过转染IL-3依赖型细胞进一步验证，发现没有IL-3转染突变体人仍能生长，而MAP2K1则不可生长，同时使用曲美替尼抑制，发现只有突变体被抑制生长
• 图S8C：在裸鼠中注射各个细胞，发现突变体可以形成Tumor且Tumor可被曲美替尼抑制

图S8. MAP2K1突变的细胞学验证

5.LUAD的全转录组分析

• 图2A：对样本中变异程度最大的前100个基因，通过k均值聚类分析将队列分为两簇
• 图2B：将Clinical Information、变谱与基因表达数据进行了综合分析并使用Fisher检验，发现基因簇1(图2A左边部分)癌症高阶段的Patients比例低于基因簇2
• 图2C：对两个基因簇进行生存分析，发现基因簇1的OS和RFS优于基因簇2
• 图S9：通过GSEA分析，发现E2F_TARGETS基因集富集于基因簇2

图2. 对变异程度大的基因进行分类

作者随后通过对13,000多个基因进行单变量Cox分析，得到192个基因与OS显著相关。随后筛选出14个假阳性率≤0.03的基因，并通过前向条件逐步回归与多变量Cox分析构建预后模型，最终得到构建预后模型的三个基因CCL8，MIS18A和C1orf131，公式为：

(n为预后基因数量，expi为表达等级，βi是基因i的回归系数)

• 图3A：使用预后模型预测队列的风险评分，并通过手动设置75%为阈值分成高风险组和低风险组
• 图3B：对高风险组与低风险组进行生存分析，在癌症所有阶段低风险组OS与RFS优于高风险组
• 图3C：分析LUADPatients基因表达情况，并鉴定出高风险评分中高表达的前100个基因和低表达的前100个基因
• 图3D：GSEA分析高风险组与低风险组，发现E2F靶基因、MYC靶基因和G2M检查点在高风险组处富集

图3. 预后模型的构建与验证

表2：通过多变量分析验证预后模型，发现在改变EGFR和ALK状态，风险评分仍有意义

表2. 多变量分析验证预后模型

图4A：展示各个组织亚型LUAD中驱动基因突变的人数，发现共有679名Patients被证明有驱动基因，且突变分布在所有肺癌组织学亚型中

图4B：对各个年龄段的基因突变情况，展示了40岁及以下的Patients驱动基因突变情况

图4. LUAD亚型中驱动基因突变情况

最后小结一下，作者首先分析了996例日本LUAD临床和病理特征随后对对125例驱动基因阴性的日本LUAD进行了进行全外显子测序和/或RNA测序，在88例(70.4%)Patients中发现了与TCGA不同的特定热点突变，同时鉴定出FGFR2和NRG2α的两个新融合。随后作者基于mRNA表达谱聚类可以预测Patients的预后，并构建了由三个基因组成的预后模型。最后作者统计了驱动基因在LUAD各组织类型的数量，每个驱动基因分布在所有组织学亚型中。作者还做了年龄与驱动基因突变的分析。