winform根据分辨率自适应_【封面文章】自适应光学在荧光显微镜中的应用

本文为中国激光第1825篇。

欢迎点击在看、转发，让更多人看到。

西安电子科技大学刘立新副教授和郜鹏教授课题组在《激光与光电子学进展》发表题为“自适应光学在荧光显微镜中的应用”的特邀综述文章，从技术与应用两个维度，综述了自适应光学技术近年来在荧光显微成像领域的应用及最新研究进展，分析了其进一步发展需要突破的关键问题及未来发展方向。

封面文章| 刘立新,张美玲,吴兆青,杨乾乾,郜鹏,薛平. 自适应光学在荧光显微镜中的应用[J]. 激光与光电子学进展, 2020, 57(12): 120001

撰稿|刘立新,张美玲

01  研究背景

荧光显微镜具有对样品损伤小、可特异性标记、适于活体成像等优点，一直是生物医学研究中的主要手段。

但由于光学系统自身缺陷、生物样品光学性质的不均匀性以及样品与显微镜浸润介质界面折射率的变化等导致了像差的产生。

像差的存在使显微成像很难达到衍射极限的分辨率。像差对不同的显微镜有着不尽相同的影响，但在所有情况下都会导致图像对比度和分辨率的降低，而且随着生物组织成像深度的增加，像差问题变得越来越严重，使得荧光显微镜无法对活体生物组织的深层进行高分辨率成像。

自适应光学(AO)技术通过使用可变形镜(DM)或空间光调制器(SLM)等校正元件对动态光学波前误差进行校正，进而改善光学系统的成像性能。因此，越来越多的研究人员将AO与荧光显微镜相结合，以修正动态波前像差并改善成像质量。

02  自适应光学的基本原理

典型的AO系统包括波前探测器、波前控制器和波前校正器三个部分，如图1所示。

其工作原理为：

1)首先由波前探测器对来自目标或目标附近的信标光源的光学波前误差进行实时探测；

2)然后由波前控制器对误差进行处理并转换成波前校正器的控制信号并驱动其开始工作；

3)最后由波前校正器将控制信号转变为波前相位变化，对像差进行补偿和校正，使波前恢复到畸变之前的状态，消除动态波前误差。

图1 典型自适应光学系统结构图

03  AO荧光显微镜及其应用

根据成像方式的不同，荧光显微镜可以分为宽场成像显微镜和点扫描成像显微镜两大类。

3.1

宽场成像显微镜

在宽场成像显微镜中，通过相干光或非相干光聚焦于物镜的后焦平面进而在样品空间形成近似平行的照明光，照明光对样品较大范围进行照射并激发荧光，最后通过面阵探测器进行探测成像。

然而，在利用面阵探测器进行探测时，成像光路中的荧光图像会直接呈现在探测器上，导致成像质量受到波前像差的影响。

因此，对于宽场成像显微镜，成像光路的AO校正是必须的。

宽场成像显微镜主要包括普通宽场荧光显微镜、结构光照明显微镜以及单分子定位显微镜等。

普通宽场荧光显微镜 

普通宽场荧光显微镜的照明方式为柯勒照明，照明光路的像差对成像质量没有影响，所以只需要对成像光路进行自适应校正，如图2所示。

通过基于模型的寻优算法以及相位恢复波前传感机制可以实现无波前传感的间接波前探测，具有较为理想的校正效果。基于夏克-哈特曼波前传感器(SHWS)的直接波前探测方法需要借助导引星对像差进行探测，因此，科研人员通过利用荧光微球、荧光蛋白等人工导星以及生物组织的背向散射光实现了生物组织微米量级的成像。

图2 共轭AO宽场显微镜系统及AO校正前后成像对比

结构光照明显微镜

结构光照明显微镜(SIM)通过结构化照明在频率域以空间混频的方式将物体的高频信息载入到光学系统的探测通频带内，进而实现突破衍射极限的超分辨成像。

SIM的结构光质量和照明光路对像差敏感，所以需要对其照明光路和成像光路进行共同校正，如图3所示。2017年，Li等利用基于woofer-tweeter双变形镜和波前传感器的自适应光学结构光照明显微镜系统实现了更加快速的像差探测与校正。

图3 AOSIM系统及AO校正前后成像对比

单分子定位显微镜

单分子定位显微镜主要包括光敏定位显微镜(PALM)和随机光学重构显微镜(STORM)。通过利用具有开关效应的荧光分子标记样品，并对这些荧光分子进行稀疏激发、分时成像，获得单分子荧光图像，然后对荧光分子精确质心定位，最后将不同时刻获得的成千上万个单分子定位信息叠加，获得纳米分辨图像，实现超分辨成像。

对于单分子定位显微镜，只需对成像光路进行自适应校正，如4所示。2013年Burke等提出了一种基于图像锐度度量的寻优算法，应用于PALM中实现了像差校正和成像质量改善。Tehrani等相继提出基于遗传算法和粒子群优化算法的AO-STORM，实现了STORM数据采集过程中畸变波前的实时校正。

图4 AO单分子定位显微镜系统及AO校正前后成像对比

3.2

点扫描成像显微镜

在点扫描成像显微镜中，点光源发出的光经扩束、准直后以平行光的形式入射到显微物镜，经物镜聚焦后的聚焦光斑照射样品中的某一点并激发出荧光。荧光由成像系统收集然后利用点探测器进行探测，最终通过点扫描的方式进行成像。

可见，样品的像差会对照明光路中的聚焦点产生影响，使焦点弥散，导致无法对样品激发出荧光或在离焦面产生不必要的背景光。

因此，对于点扫描成像显微镜，照明光路的校正是必须的。

点扫描成像显微镜主要包括共聚焦荧光显微镜、双(多)光子荧光显微镜以及受激发射损耗显微镜等。

共聚焦荧光显微镜

共聚焦荧光显微镜利用激光作为激发光源，在光电探测器前放置一个针孔，使针孔与点光源共轭以滤除杂散光，通过对样品进行逐点、逐层扫描从而实现对样品的高分辨率三维成像。

共聚焦荧光显微镜的照明光路和成像光路均需进行自适应校正，如图5所示。Tao课题组利用荧光微球、荧光蛋白标记结构及荧光蛋白中心体等作为SHWS的导引星，实现了对畸变波前的直接测量并利用DM对其进行了校正。间接波前探测方面，随机并行梯度下降算法得到广泛应用并获得较好的校正效果。

图5  AO共聚焦显微镜系统及AO校正前后成像对比

双(多)光子荧光显微镜

双(多)光子荧光显微镜基于双(多)光子激发这一非线性效应，只在焦点附近的微小区域对样品进行激发，探测器前无需利用针孔滤除杂散光，因此只需对照明光路进行像差校正，如图6所示。

基于孔径分割的无波前传感AO方法被应用于双光子荧光显微镜中实现了大视场、大成像深度的生物组织显微成像。基于SHWS和DM的直接法应用于双光子显微镜中实现了果蝇胚胎、小鼠大脑等组织中像差的直接探测与校正。

图6 AO双光子显微镜系统及AO校正前后成像对比

受激发射损耗(STED)显微镜

受激发射损耗(STED)显微镜通过引入一束损耗光以受激发射的方式来抑制有效荧光的发射，进而实现超分辨成像。

STED的三条光束路径(激发光路、耗尽光路、发射光路)都会受到像差影响，因此对所有光路进行自适应校正是十分必要的，如图7所示。

Gould等人和Patton等人分别利用含有两个SLM以及含有DM和SLM两种校正元件的AO-STED系统对不同的光束路径进行像差校正，实现了对厚生物组织(如斑马鱼视网膜切片等)的三维超分辨成像。

图7 AO-STED显微镜系统及AO校正前后成像对比

04  总结与展望

大视场、大深度、快速的高分辨率活体显微成像为生物学提供更加准确的影像信息，在这一过程中，AO技术发挥了重要的作用。然而，随着相关技术的不断发展，生物组织的深层动态荧光成像对AO在荧光显微镜中的应用提出了更多的要求。

首先，AO应用于显微成像系统后会导致高分辨率成像视场减小，针对这个问题可以通过共轭AO、多层共轭AO并结合更加高效的共轭校正算法扩大显微成像视场。

其次，生物组织中的波前畸变往往是不断变化的，要想对其进行实时的探测与校正就必须加快波前畸变的探测速度和波前校正器的校正速度，实现AO系统的高速实时化。

最后，研究深层组织的大视场和高时空分辨率成像是当前成像领域的一个前沿问题，未来生物医学成像也对成像深度提出了更高的要求，因此需要借助AO 技术进一步推动深层高分辨荧光显微成像的发展。

课题组介绍

西安电子科技大学刘立新副教授与郜鹏教授组建了先进光学显微与光谱技术科研团队，目前由10名教职工和14名硕博研究生组成。

该团队与中科院西安光机所瞬态光学与光子技术国家重点实验室联合建立“瞬态-物光先进成像联合实验室”，共同致力于研究新型光学显微与光谱技术，为生物医学和材料学提供先进优良的观测手段；同时，将所研制的技术向产业化方向推进，填补我国在高端显微镜市场上的空白。

团队主要研究方向包括超分辨显微、定量相位显微、荧光寿命成像、高光谱成像、拉曼光谱技术和荧光相关光谱技术等。团队主持承担国家自然科学基金面上项目、国家自然科学基金青年基金项目和陕西省自然科学基金项目等多项国家级和省部级项目，已在高水平国际学术期刊发表研究论文100余篇。

End

推荐阅读

姚保利：【封面】活体样品的长时间三维成像——光片荧光显微术

陈理想：关联成像技术的研究现状及展望

卢荣胜：机器人视觉三维成像技术

邵晓鹏：计算成像技术及应用最新进展

曹良才，金国藩，白瑞迪：【封面论文】基于压缩感知算法的无透镜数字全息成像研究

首发前沿光学成果，放送新鲜光学活动

如需转载，请直接留言。

商务合作：朱先生 13918384218

免责声明

本文注明来源为其他媒体或网站的文/图等稿件均为转载，如涉及版权等问题，请作者在20个工作日之内来电或来函联系，我们将协调给予处理(按照法规支付稿费或删除)。

最终解释权归《中国激光》杂志社所有。