storm显微镜成像原理_STORM 超分辨显微成像 – Prime 95B 应用

背 景

纽约大学医学院Rothenberg博士实验室使用新型光学成像技术，研究纳米尺度上的生物分子及其反应过程。他们致力于研究酶和蛋白参与致癌DNA损伤修复的机制，并开发新的观察单个生物分子行为的成像方法。STORM显微成像可对细胞中DNA的复制进行定位和跟踪。在Dr.Rothenberg研究组从事博后工作的Yandong Yin博士表示：“我们需要观察癌细胞核中DNA的复制过程，标记相关的DNA和蛋白，以便了解DNA复制时到底发生了什么。”

面临的挑战

研究面临的挑战之一是细胞核内的许多标记物会堆积在一起，有些标记物特别小，很难清楚地被分辨。为了研究每个标记物在空间上的组织结构，他们通常要对样品进行三或四种颜色的STORM成像，因此需要具有高分辨率、高灵敏度和高定位精度的成像技术。“DNA复制叉非常小，只有超分辨技术才能对它进行成像。” Dr. Yin说。为了提高荧光基团点扩散函数的拟合精度，该实验室的STORM图像后处理算法中引入了对相机芯片像素差异的校准。因此，CMOS相机固有的像素之间的差异，如图案噪声(Pattern noise)，就成为他们关心的主要问题。

解决方案

在单分子荧光定位成像中，EMCCD被CMOS技术取代已是大势所趋。与前一代前照式sCMOS相机相比，像元更大并采用背照式芯片的Prime 95B灵敏度显著提升，图案噪声也得到了更有效的控制，使其成为在该应用上取代EMCCD相机的首选。

Dr. Yin表示，“我们最终需要拟合出每个单分子点的中心坐标，这个过程中最重要的是使用什么样的拟合算法”。由于图案噪声的大大减小，定位和重建多种色彩的荧光基团变得更加容易，从而大大降低了图像后处理过程的难度。 他还指出：“Prime 95B像素间的差异远小于其他sCMOS相机，超过90%像素的噪声分布在非常窄的区域，即他们之间的噪声差异很小。”

此外，相机的大视野能够帮助研究者更快地找到需要拍摄的区域。Dr. Yin说：“以前我们使用的EMCCD芯片尺寸很小，经常要花很多时间才可以找到感兴趣的成像区域。在对像元尺寸做了光学匹配后，Prime 95B的有效视野比EMCCD提高了5倍，定位样品变得更加容易，单张照片采集到的信息也大大提高。”

图 像

细胞类型：U2OS 细胞

曝光时间：30 ms

放大倍率： 150 倍 (配置的像素大小约为73 nm)

重建算法：单PSF拟合的极大似然估计(MLE)算法

附加信息

http://med.nyu.edu/biomolpharm/research/biochemistry-macromolecules/eli-rothenberg