rna聚类分析_【陈巍学基因】RNA-seq

RNA-seq是高通量测序中最常见的一种应用，本期视频介绍其：
1.方法原理
2.生物信息分析

• 表达差异
  （1）火山图展示
  （2）聚类分析
  （3）GO分析
  （4）Pathway分析（KEGG分析）
• 结构变异
  （1）可变剪接
  （2）融合基因
  （3）点突变

RNA高通量测序（RNA-sequencing,缩写为RNA-seq）是目前高通量测序技术中被用得最广的一种技术，RNA-seq可以帮助我们了解：各种比较条件下，所有基因的表达情况的差异。它可以检测的差异有：正常组织和肿瘤组织的之间的差异；也可以检测药物治疗前后基因表达的差异；还可以检测发育过程中，不同的发育阶段，不同的组织之间的基因表达差异。诸如此类。那么在所有检测的差异类型中，最常见的，就是检测所有mRNA的表达量的差异，这是最常用的一种检测。同时，我们还可以检测 RNA 的结构上的差异。例如：mRNA的剪接方式的差异，也就是我们一般说的可变剪接，还可以检测融合基因，同时还可以检测基因单点突变导致的SNP（Single Nucleotide Polymorphisom)。
接下来，我们分成RNA-seq测序方法和RNA-seq测序数据分析两个部分，分别介绍RNA-seq。

RNA测序方法
在测mRNA的过程当中，首先要解决的问题，是如何去除核糖体RNA也就是去除“rRNA”(Ribosomal RNA)。在通常抽提到的总RNA中，绝大部分都是核糖体RNA（rRNA）。以人类的细胞或组织为例，一般抽提到的总RNA当中，95%都是核糖体RNA。剩下的2%到3%是mRNA。还有呐，2%到3%是Long non-coding RNA、或者tRNA、microRNA,这些RNA，也就是说mRNA只占了所有RNA中的一小部分。

如果我们把所有的RNA都拿来测序的话，测到的绝大部分的序列数据都是核糖体RNA。而且这当中（rRNA）比例会高达95%左右，但是，核糖体RNA在整个人类当中都是非常保守的，而且在人的各个组织、器官当中也是极度稳定的。也就是说，测rRNA，它得到的数据，并不能为我们实验者提供什么有用的信息，而mRNA才是RNA当中信息含量最丰富的那个部分。
我们一般的RNA-seq要测的，也是mRNA的各种变化，所以在实验过程当中，我们一般要把核糖体RNA先去掉。然后再进行建库测序。
去除核糖体RNA，并进行建库的方法，有许多种。我们主要介绍一下应用最广泛的illumina公司的TruseqRNA建库方法。
下图是mRNA测序的建库过程图。首先是利用高等生物的mRNA都有Poly(A)尾巴这个特点，用带有Poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交。然后Poly(T)探针就和带Poly(A)尾巴的mRNA结合在一起，接下来就回收磁珠，然后把这些带Poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。

再把这些洗脱下来的mRNA用镁离子溶液进行处理。镁离子溶液会把mRNA打断

被打断的这些mRNA片段，再用随机引物进行逆转录

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