RNAseq_Expression分析教程

 

https://pmbio.org/module-06-rnaseq/0006/02/01/RNAseq_Expression/

学习目标：

• 进行RNA-seq数据的比对和所得比对的基本QC分析
• 获得基因和转录本丰度估计值
• 执行无参考对齐和丰度估计，并将结果与基于参考的方法进行对比
• 基本差异表达分析
• 执行表达异常值分析
• 运行RNA融合检测工具并解析有趣候选人的结果
• 评估相关特定基因标记的表达（例如HER2，ER，PR）
• 评估前面部分中确定的特定变体的表达。
• 确定等位基因特异性表达的一个例子

弄清楚我们的RNA数据是否已被修剪。

接头序列修剪FASTQ文件
接头序列修整的目的是删除我们的数据中与Illumina接头序列对应的序列。 最常见的接头序列修整方案是删除在读取序列结束时发生的接头序列序列。 当DNA（或cDNA）片段短于读取长度时，会发生这种情况。 例如，如果我们将我们的RNA-seq片段测序为150个碱基长度并且片段仅长140个碱基，那么读取将以10个碱基的衔接子序列结束。 由于该衔接子序列与基因组不对应，因此不会对齐。 过多的接头序列实际上可以防止读段完全对齐。 因此，接头序列修整有时可以提高RNA-seq数据集的整体对齐成功率。 接头序列修整本身涉及简单的对齐，因此计算成本高。

cd ~/workspace/inputs/references
wget -c http://genomedata.org/rnaseq-tutorial/illumina_multiplex.fa
cd ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Tumor
#runtime: ~25min each flexbar command
flexbar --adapter-min-overlap 7 --adapter-trim-end RIGHT --adapters ~/workspace/inputs/references/illumina_multiplex.fa --pre-trim-left 13 --max-uncalled 300 --min-read-length 25 --threads 8 --zip-output GZ --reads RNAseq_Tumor_Lane1_R1.fastq.gz --reads2 RNAseq_Tumor_Lane1_R2.fastq.gz --target ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Tumor/RNAseq_Tumor_Lane1
flexbar --adapter-min-overlap 7 --adapter-trim-end RIGHT --adapters ~/workspace/inputs/references/illumina_multiplex.fa --pre-trim-left 13 --max-uncalled 300 --min-read-length 25 --threads 8 --zip-output GZ --reads RNAseq_Tumor_Lane2_R1.fastq.gz --reads2 RNAseq_Tumor_Lane2_R2.fastq.gz --target ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Tumor/RNAseq_Tumor_Lane2

cd ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Norm
flexbar --adapter-min-overlap 7 --adapter-trim-end RIGHT --adapters ~/workspace/inputs/references/illumina_multiplex.fa --pre-trim-left 13 --max-uncalled 300 --min-read-length 25 --threads 8 --zip-output GZ --reads RNAseq_Norm_Lane1_R1.fastq.gz --reads2 RNAseq_Norm_Lane1_R2.fastq.gz --target ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Norm/RNAseq_Norm_Lane1
flexbar --adapter-min-overlap 7 --adapter-trim-end RIGHT --adapters ~/workspace/inputs/references/illumina_multiplex.fa --pre-trim-left 13 --max-uncalled 300 --min-read-length 25 --threads 8 --zip-output GZ --reads RNAseq_Norm_Lane2_R1.fastq.gz --reads2 RNAseq_Norm_Lane2_R2.fastq.gz --target ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Norm/RNAseq_Norm_Lane2

mkdir -p ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Tumor/trimmed
mkdir -p ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Norm/trimmed
mv ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Tumor/RNAseq_Tumor_Lane1_1.fastq.gz ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Tumor/trimmed/RNAseq_Tumor_Lane1_R1.fastq.gz
mv ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Tumor/RNAseq_Tumor_Lane1_2.fastq.gz ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Tumor/trimmed/RNAseq_Tumor_Lane1_R2.fastq.gz
mv ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Tumor/RNAseq_Tumor_Lane2_1.fastq.gz ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Tumor/trimmed/RNAseq_Tumor_Lane2_R1.fastq.gz
mv ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Tumor/RNAseq_Tumor_Lane2_2.fastq.gz ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Tumor/trimmed/RNAseq_Tumor_Lane2_R2.fastq.gz

mv ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Norm/RNAseq_Norm_Lane1_1.fastq.gz ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Norm/trimmed/RNAseq_Norm_Lane1_R1.fastq.gz
mv ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Norm/RNAseq_Norm_Lane1_2.fastq.gz ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Norm/trimmed/RNAseq_Norm_Lane1_R2.fastq.gz
mv ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Norm/RNAseq_Norm_Lane2_1.fastq.gz ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Norm/trimmed/RNAseq_Norm_Lane2_R1.fastq.gz
mv ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Norm/RNAseq_Norm_Lane2_2.fastq.gz ~/workspace/inputs/data/fastq/RNAseq_Norm/trimmed/RNAseq_Norm_Lane2_R2.fastq.gz