实验记录 | 8/8 阶段性结果整理（二）

最新推荐文章于 2022-04-28 16:27:09 发布
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分类专栏： 谱系追踪
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接下来就是验证自己非常感兴趣的一些论题了。
1、去除BQSR&indel realignment环节，对于结果的影响。
2、lofreq&strelka结果的影响。

现在要做的事情就是选择要比较的样本（运行时间相对比较短的）。然后修改somatic.pl的代码。总体上说来就是，把模糊的任务拆分成具体可行的步骤，然后一点点的一丝不苟的去执行。

现在敲定，选择NBMA3、OX1931B10、OX1071A5作为测试的数据集，选择的原因主要是，数据量小，可能运行起来会相对而言比较快一点。

（13:57）现在开始修改somatic.pl这个代码文件，来继续做。
（14:11）将代码文件修改完成了。

现在就是执行批处理的指令。

perl /home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic.pl NA	NA RNA:/home/xxzhang/workplace/QBRC/data/CML/TESTclass/SRR3052202_1.fastq.gz	NA 32	hg38	/home/xxzhang/workplace/QBRC/geneome/hg38/hg38.fasta /home/xxzhang/miniconda3/bin/java /home/xxzhang/workplace/QBRC/output/NBMA3/	human	1	./disambiguate_pipeline
perl /home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic.pl NA	NA RNA:/home/xxzhang/workplace/QBRC/data/CML/TESTclass/SRR3052561_1.fastq.gz	NA 32	hg38	/home/xxzhang/workplace/QBRC/geneome/hg38/hg38.fasta /home/xxzhang/miniconda3/bin/java /home/xxzhang/workplace/QBRC/output/OX1931B10/	human	1	./disambiguate_pipeline
perl /home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic.pl NA	NA RNA:/home/xxzhang/workplace/QBRC/data/CML/TESTclass/SRR5296837_1.fastq.gz	NA 32	hg38	/home/xxzhang/workplace/QBRC/geneome/hg38/hg38.fasta /home/xxzhang/miniconda3/bin/java /home/xxzhang/workplace/QBRC/output/OX1071A10/	human	1	./disambiguate_pipeline

修改之后的代码文件有一点点的错误，连我的计算机就开始抱怨有太多的错误了哈哈。
我们来一点点的修改。

Bareword found where operator expected at /home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic. pl line 440, near "system(“date”
(Might be a runaway multi-line “” string starting on line 438)

system_call("mv ".$type_output."/dupmark.bam  ".$type_output."/".$type.".bam );  #漏掉了字符串后面的双引号
修改为：
system_call("mv ".$type_output."/dupmark.bam  ".$type_output."/".$type.".bam");

String found where operator expected at /home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic.pl line 440, near “# if (KaTeX parse error: Expected '}', got 'EOF' at end of input: pdx=~/mouse/) {known=”"
(Missing semicolon on previous line?)
String found where operator expected at /home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic.pl line 440, near “known “. r e s o u r c e d b s n p . " " ( D o y o u n e e d t o p r e d e c l a r e k n o w n ? ) S t r i n g f o u n d w h e r e o p e r a t o r e x p e c t e d a t / h o m e / x x z h a n g / w o r k p l a c e / Q B R C / / s o m a t i c . p l l i n e 440 , n e a r " k n o w n " . resource_dbsnp."" (Do you need to predeclare known?) String found where operator expected at /home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic.pl line 440, near "known ". resourced​bsnp.""(Doyouneedtopredeclareknown?)Stringfoundwhereoperatorexpectedat/home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic.plline440,near"known".resource_mills.””
(Do you need to predeclare known?)
String found where operator expected at /home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic.pl line 440, near “known “.$resource_1000g.””
(Do you need to predeclare known?)

syntax error at /home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic.pl line 440, near "system( “date”
Regexp modifiers “/d” and “/u” are mutually exclusive at /home/xxzhang/workplace /QBRC//somatic.pl line 441, at end of line
Regexp modifiers “/d” and “/a” are mutually exclusive at /home/xxzhang/workplace /QBRC//somatic.pl line 441, at end of line

Unknown regexp modifier “/r” at /home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic.pl line 44 1, at end of line
Unknown regexp modifier “/k” at /home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic.pl line 44 1, at end of line
Unknown regexp modifier “/h” at /home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic.pl line 44 1, at end of line
Unknown regexp modifier “/e” at /home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic.pl line 44 1, at end of line
Unknown regexp modifier “/w” at /home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic.pl line 44 1, at end of line
Unknown regexp modifier “/r” at /home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic.pl line 44 1, at end of line
Unknown regexp modifier “/k” at /home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic.pl line 44 1, at end of line
/home/xxzhang/workplace/QBRC//somatic.pl has too many errors.

主要就是440行的那一处的引号少了，其他没有什么。
重新提交，看看能不能使用。

（14:40）完成，现在在运行中。

########################################################################################
#这串代码之后我好像有比较过
setwd("F://张秀秀//过程性文件//8//8//NBMA3")
new_gremline<-read.table("germline_mutations_hg38_new.txt",sep = "\t",header = T)
old_gremline<-read.table("germline_mutations_hg38_old.txt",sep = "\t",header = T)
dim(new_gremline) #1553
dim(old_gremline) #1518
#为了确保准确性，这次不进行位点的比较（因为不同染色体会有不同的位点。这也没办法说服我自己），
#而是将我们关注的几个信息合并后进行比较
new_gremline<-within(new_gremline, mutation<- paste(Chr,Start,Ref,Alt,sep=" "))
old_gremline<-within(old_gremline, mutation<- paste(Chr,Start,Ref,Alt,sep=" "))
new_mutation<-new_gremline$mutation
old_mutation<-old_gremline$mutation
#然后就是一个简单的venn plot
library(VennDiagram)
# 二维韦恩图
venn.plot <- venn.diagram(
  x = list(Removal=new_mutation,Original=old_mutation),
  filename = NULL,
  lwd = 4,
  fill = c("cornflowerblue", "darkorchid1"),
  alpha = 0.75,
  label.col = "black",
  cex = 2,
  fontfamily = "serif",
  fontface = "bold",
  cat.col = c("cornflowerblue", "darkorchid1"),
  cat.cex = 1,
  cat.fontfamily = "serif",
  cat.fontface = "bold",
  cat.dist = c(0.03, 0.03),
  cat.pos = c(-20, 14),
  main = "NBMA3 patient(%)"
)
grid.draw(venn.plot)
grid.newpage()

#######################################################################################
#这串代码之后我好像有比较过
#F:\张秀秀\过程性文件\8\8\OX1071A10
setwd("F://张秀秀//过程性文件//8//8//OX1071A10")
new_gremline<-read.table("germline_mutations_hg38_new.txt",sep = "\t",header = T)
old_gremline<-read.table("germline_mutations_hg38_old.txt",sep = "\t",header = T)
dim(new_gremline) #1668
dim(old_gremline) #1609
#为了确保准确性，这次不进行位点的比较（因为不同染色体会有不同的位点。这也没办法说服我自己），
#而是将我们关注的几个信息合并后进行比较
new_gremline<-within(new_gremline, mutation<- paste(Chr,Start,Ref,Alt,sep=" "))
old_gremline<-within(old_gremline, mutation<- paste(Chr,Start,Ref,Alt,sep=" "))
new_mutation<-new_gremline$mutation
old_mutation<-old_gremline$mutation
#然后就是一个简单的venn plot
library(VennDiagram)
# 二维韦恩图
venn.plot <- venn.diagram(
  x = list(Removal=new_mutation,Original=old_mutation),
  filename = NULL,
  lwd = 4,
  fill = c("cornflowerblue", "darkorchid1"),
  alpha = 0.75,
  label.col = "black",
  cex = 2,
  fontfamily = "serif",
  fontface = "bold",
  cat.col = c("cornflowerblue", "darkorchid1"),
  cat.cex = 1,
  cat.fontfamily = "serif",
  cat.fontface = "bold",
  cat.dist = c(0.03, 0.03),
  cat.pos = c(-20, 14),
  main = "OX1071A10 patient(4.4%)"
)
grid.draw(venn.plot)
grid.newpage()

############################################################################################
setwd("F://张秀秀//过程性文件//8//8//OX1931B10")
new_gremline<-read.table("germline_mutations_hg38_new.txt",sep = "\t",header = T)
old_gremline<-read.table("germline_mutations_hg38_old.txt",sep = "\t",header = T)
dim(new_gremline) #2572
dim(old_gremline) #2367
#为了确保准确性，这次不进行位点的比较（因为不同染色体会有不同的位点。这也没办法说服我自己），
#而是将我们关注的几个信息合并后进行比较
new_gremline<-within(new_gremline, mutation<- paste(Chr,Start,Ref,Alt,sep=" "))
old_gremline<-within(old_gremline, mutation<- paste(Chr,Start,Ref,Alt,sep=" "))
new_mutation<-new_gremline$mutation
old_mutation<-old_gremline$mutation
#然后就是一个简单的venn plot
library(VennDiagram)
# 二维韦恩图
venn.plot <- venn.diagram(
  x = list(Removal=new_mutation,Original=old_mutation),
  filename = NULL,
  lwd = 4,
  fill = c("cornflowerblue", "darkorchid1"),
  alpha = 0.75,
  label.col = "black",
  cex = 2,
  fontfamily = "serif",
  fontface = "bold",
  cat.col = c("cornflowerblue", "darkorchid1"),
  cat.cex = 1,
  cat.fontfamily = "serif",
  cat.fontface = "bold",
  cat.dist = c(0.03, 0.03),
  cat.pos = c(-20, 14),
  main = "OX1931B10 patient(9.6%)"
)
grid.draw(venn.plot)
grid.newpage()

绘制完成了韦恩图。这个结果其实在我们的预料之中，我不知道作者的这个0.1%是如何计算出来的。我图中的这个百分数，用的是（和它不同的variant的数目/相同的variant的数目）计算得到的。
在这里插入图片描述
另外，其实作者还说了，用不用这个数据还跟数据的平均测序深度有关。
作者文章中用到的数据的平均测序深度是55-fold。
在这里插入图片描述
那么，我想要知道我们的数据的平均测序深度是多少？
记得师姐说这个数据来源于大脑的初级视觉皮层，测序深度相对来说比较高，也是50多。
但是，我不确定。

平均测序深度：每一个位点平均测到的次数。这个值越高，表示测序的可靠性就越高。

现在回到sam的文件夹（终于到我们自己的数据了，我现在对于这个数据还非常的不熟悉）。
我想看一下这个数据文件的平均的测序深度。使用Samtools工具进行计算。
当我尝试进行转换的时候：

samtools view -bS ATGAGCCGTAAGCTTG.sam >ATGAGCCGTAAGCTTG.bam

[E::sam_parse1] no SQ lines present in the header
[W::sam_read1] Parse error at line 3

显示错误。说没有文件的头部，没有SQ的行（啊，我对sam文件的格式也并不是特别的了解。。）。
根据网上的介绍，SQ的信息大概是这个样子：

@SQ SN:chr1 LN:248956422
@SQ SN:chr10 LN:133797422
@SQ SN:chr11 LN:135086622
@SQ SN:chr11_KI270721v1_random LN:100316
@SQ SN:chr12 LN:133275309
@SQ SN:chr13 LN:114364328
@SQ SN:chr14 LN:107043718
@SQ SN:chr14_GL000009v2_random LN:201709
@SQ SN:chr14_GL000225v1_random LN:211173

也就是位于sam文件开头的，关于序列文件的染色体的信息。
而我们的sam文件的格式是这样的。

TTGTCATATTATA00583:531:HW5FTDSXY:2:1131:28176:8015      77      *       0       0       *       *       0     0TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTAAAATAAAAATTAATATCTAAAAATATAATGATAAACAATTTATAAAAAAACAATATTATATAAAAAAAAATTAAAAAAAAAACA FFFFFFFFFFFFFFF,:FF,:F,FFF,F,F,F:,,F:F,F,FF:F,FF::F:F,,,FFFFF:,,,FFFFFFF,F::F,,:F,F,FF:FF:,FF,FF,:,,,:FF::,,:  NH:i:0   HI:i:0  AS:i:148        nM:i:0  uT:A:1
TTGTCATATTATA00583:531:HW5FTDSXY:2:1131:28176:8015      141     *       0       0       *       *       0     0GATTAACCTCTTTGTGCCTCAGTTTCCTCAGCTATAAAACAGAATGATAATATTAACCCCCTCCTAGGATTGATTTCAGATGCAAATGATTACTACTATCTACCATATATAAACAATGTACTTATAGAATATATGTGTATTATGTACTAT :FFFFFFFFF:FFFF:FFF:F:F,,FFFFFF,FFFFFFF:FFFFFFFFFFFF,FFFFF:FFFFFFF:,FFF:FF:FFF,FFFFFFFFFF::FFFFFF:F::FFFFFFF::FFFFFF::,FFF:FFFFFFFFFFFF,FFF:FFF,FF:FFF NH:i:0  HI:i:0  AS:i:148      nM:i:0   uT:A:1
TTCGACTACATGA00583:531:HW5FTDSXY:2:1131:4616:20134      163     chrX    13940636        255     150M    =     13940852 287     GATGGCTAGTAAGTATATTTCATTTCACTATTATTCAAAGAAATGCTATCTTAAAATAATAAACCATTTTTCTCAAGTAACTGAAATCTTTAAAAATTAAAGCAAGATTACACCTGCAGGTGGGTGAGTCAATTGGTCTAGCCTTTCTGG FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFF:FFFFFFFF:FFFFF:FF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFF NH:i:1  HI:i:1AS:i:199 nM:i:10

我有点不太明白。自己转换的到底对不对。
所以，我现在遇到的主要的问题是：
（1）我想改造这个pipeline，尤其是去掉BQSR环节，但是不知道这额外带来的假阳性的结果，对于结果会产生怎样的影响？究竟怎样的“度”会比较合适？在运行的效率和质量上怎样达到一种平衡？==>在这边我或许也可以咨询一下作者。
（2）对于10X的数据我自己不够熟悉。

  • 目前按照作者提供的pipeline虽然拆分出来了一些细胞，但是不知道对不对？
  • 10X的数据如何实现对mRNA的定性和定量的处理，在这一方面我觉得是我不太了解的地方。我需要继续的学习。
  • 一个前提是：10X的数据，肯定是可以用来做的。因为作者的文章中也使用了10X的数据。

这里补一句：作者的文章中也用到了10X的数据。他得到的主要的结果是：
这篇文章中，他虽然使用了10X的数据，但是好像所列出的结果是，在这个数据中突变的类型，就是下面我们这张图中显示的：
在这里插入图片描述

那我们接下来，目标就非常明确了。
（1）优化pipeline。==>运行时间上优化，在效率和质量上达到一个平衡。
（2）理解10X的数据的结构。 ==>calling出来的variant非常的少，我不知道这属不属于一种正常的现象。我还没有深入的去研究。
但是，我在文献中看到的结果是：
一个成熟的神经细胞中的突变，可以达到几百个。
在这里插入图片描述
==>多读文献。
==>多读作者的源代码。
==>整理好自己的疑惑，跟作者联系。

对了，关于running time，作者是这样说的。

For a paird of 'fastq.gz’files of 200M, it takes around 2 hours to finish somatic mutation calling.
但是实际上，我自己的计算的经验是即使是1M左右的数据，也需要将近50min左右。

明天的任务，就是把最近要读的文献集中整理一下。分个轻重缓急，现在乱糟糟的在桌面上，真的很容易让自己手忙教乱，没有重点。
还有的话，有时间理解一下WGCNA分析是个什么鬼。显然这应该是生信的基本功，但是我当初忘得差不多了。应该老杨的PPT还有。

今天也是个妖精头子呀
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sam to bam文件出错
fethin的博客
08-18 8873
开始学习生物信息分析，在ubuntu上运行了samtools view，结果显示错误，如下： # samtools view -@ 60 -bS *.sam > ra24p.bam [samopen] no @SQ lines in the header. 尝试改变参数也不行 就查看了sam文件 #head -10 ra24p.sam [M::bwa_idx_load_
文件与记录控制程序(1).doc
12-24
文件与记录控制程序 1. 目的 建立和规范公司文件、记录以及其他各类信息的管控。 2. 适用范围 适用于公司内部所有文件、记录、其他信息的管控 3. 相关文件 4. 定义 1. 文件：信息及其承载媒体。 2. 受控文件：对文件的制定、修改、发放、使用、标识、修改、回收、保存、销毁等 管理状态得到控制的文件。 3. 非控文件：受控文件的非控副本，因文件外发等需求产生。发放后不需要对文件的 状态进行控制，不需控制非控副本的修改，也不需进行回收。只有受控文件，才 可增领非控副本。 4. 归档：将文件和记录进行整理、保存的过程。 5. 一级文件：管理手册 6. 二级文件：程序文件 7. 三级文件：技术文件、制度类文件、品质类文件等用于规范、指导相关做作业的文 件。 8. 四级文件：即质量记录表单等，阐述所取得的结果或提供所完成活动的证据的文件 。质量记录包括但不限于电子版，纸版等形式。 9. 技术文件：设计文件、工艺文件、产品、模具和工装的图纸以及设备维护使用等文 件。 10. 设计文件：产品、过程设计开发阶段输出的文件，包括设计任务书、使用说明书等 。 11. 工艺文件：指导生产工艺和现场操作的文件，包括工艺卡片、工艺流程图、作业指 导书等。 12. 图纸类：产品、模具和工装等的图纸。 13. 设备维护使用类文件：设备的操作规程，维护保养工作指示、实验仪器资料、量检 具资料（含相关软件及电子信息）等。 14. 品质类文件：产品及生产过程品质管理相关的检验规范、检验标准、检验卡片等。 15. 管理类文件：各部门与质量管理体系相关的管理办法、规定、制度等。 16. 企业标准、技术条件：适用于本公司的各类型企业标准、技术条件。 17. 外来文件：与公司运作及产品相关的来自于公司外部的文件，如顾客标准/图纸、国 家标准、行业标准、地方标准、企业标准、法律/法规等。 18. 试制受控：量产前产品试制阶段或量产过程中变更验证阶段需现场使用的系列工艺 文件、检验文件等，因试验或试制原因无法正常受控而采取的临时受控方式。 5. 职责 1. 文控中心 1. 负责文件制订/修订和审批过程的监控、文件的受控、发放、回收、废止和销 毁； 2. 负责文控系统中文件、记录和其他资料及信息的维护、更新、存档和发布； 3. 负责对往来文控中心的文件、资料和记录进行审查、授权、放行和监督。 2. 体系专员 1. 负责公司文控系统的构架，文件和资料记录规范化模板的建立和完善； 2. 负责文控规则的宣导、培训和指导，确保相关人员理解和遵守。 3. 文件制定部门和记录保持部门 1. 负责文件的评审讨论，并按照文控中心发布的格式进行文件制订、会签、审批 、修订、废止等； 2. 负责妥善保存下发至本单位的文件，负责按照本文件的要求填写和保存记录资 料； 3. 负责将文件、记录和资料修改及异常的任何信息，上报文控中心，并协助文控 中心处理。 6. 程序 1. 文件的策划 1. 文件制订以不违背相关法律、法规、行业标准、强制性规定等为前提； 2. 各类管理体系标准和强制性法规要求形成文件的管理程序，必须形成文件； 3. 按照5.1.2文件层级架构规定的文件层级，下一级文件可作为上一级文件的细 化、分解和补充，体现遵循和引用的原则，但不可与上一级文件冲突。 4. 文件层级架构 公司文件划分为四个层级：一级文件、二级文件、三级文件和四级文件，如下 图所示： 2. 电子档文件的管理 1. 符合文控系统制订、审批流程的文件方可进入文控中心进行管制，在文控中心 无法追溯到有效受控版本的任何文件，不得用作公司各项流程作业的依据和 指引； 2. 符合文控系统制订、审批流程的文件，其原始电子档由文控中心上传共享文件 夹进行保存，访问权限仅限于一级文控和二级文控。原始电子档文件仅用于 文控员查询、以及文控员转发与文件制订/修改部门进行参考，不得打印、 拷贝或外发； 3. 文控中心通过文控系统电子平台受控的电子档PDF文件仅供有权限（详见表1 ：文控系统权限对照表）者登陆查阅，一律不得进行拷贝、打印、下载和转 发等； 4. 原则上，一、二、三级流程类管理文件不得发放纸档，只提供文控系统电子平 台的查阅。 表1 文控系统权限对照表 " 权限 "文控系统电子平台 "数据共享文件夹 " "层级 " " " " "只读 "修改 "只读 "文件修改 "记录维护 " "总经理 " " " " " （职权范围内" " " " " " "） " "总监/副总经理 " " " " " （职权范围内" " " " " " "） " "经理 " " " （职权范围内" " （职权范围内" " " " "） " "） " "主管 " " " （职权范围内" " （职权范围内" " " " "） " "） " "工程师 "
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学习记录
06-15 389
调用参数 1.txt ssssssssssss ssssssssss dddddddddddd 2222222222 sssssssssssssssss #!/usr/bin/perl use strict; use warnings; while(<>) { chomp; $_ = <>; print "$_"; } ##sssssssss...
shell(4)shell脚本中的变量
qiao_qing的博客
12-23 236
文章目录1.变量的定义2.shell脚本中变量的定义方法3.变量的转译4.Linux中命令的别名设定5.用户环境变量的更改6.利用命令的执行结果设定变量$()和``的区别：非交互模式传参7.脚本函数练习 1.变量的定义 1）定义本身 变量就是内存一片区域的地址 2)变量存在的意义 命令无法操作一直变化的目标 用一串固定的字符来表示不固定的目标可以解决此问题 2.shell脚本中变量的定义方法 1)环境级别 export a=1 在环境关闭后变量失效 2)用户级别 vim ~/.bas.
关于Carbide编译出现perl脚本错误的解决方法
Ordie的专栏
10-20 1178
也是在另外一个博客中看到的，不过现在在网上竟然搜不到了，还好我记录了下来：如果用Carbide编译任意工程，都出现类似如下的错误： ===Build Command = /c abld build WINSCW UDEB -v=== C:/WINDOWS/system32/cmd.exe /c abld build WINSCW UDEB -v   make -r  -f "/Symbian/9.1/S60_3rd_MR/EPOC32/BUILD/Symbian/Carbide/workspace/
Samtools view转sam为bam报错[main_samview] truncated file.
jiangyi_pig的博客
11-20 6714
报错分析：在shell里加nohup &bwa比对出来的sam文件里面有除注释行和比对结果以外的不明信息，转bam格式时会报错 [W::sam_read1] parse error at line 1 [main_samview] truncated file. head查看前三行内容为 [M::bwa_idx_load_from_disk] read 0 ALT contigs @SQSN:NC_050096.1LN:308452471 @SQSN:NC_0...
载入了名字空间‘cli’ 2.3.0，但需要的是＞= 2.4.0
weixin_40640700的博客
04-29 1万+
简单理解一下报错语句的意思就是载入的cli包的版本是2.3.0,但是实际要求的包的版本是2.4.0。两者之间并不匹配，产生冲突，于是在运行的过程中报错。 那这个时候，我预想的解决方法就是，更新cli包。 搜索包更新的方法ing…… install.packages("cli") 更新了一下cli包，RStudio上屏显为： trying URL 'https://cran.rstudio.com/bin/windows/contrib/4.0/cli_2.5.0.zip' Content ty
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