【Reference Reading】一种含碳硼烷胆固醇衍生物的合成及其作为MRI/BNCT双试剂的评价

论文：Synthesis of a carborane-containing cholesterol derivative and evaluation as a potential dual agent for MRI/BNCT applications（2014）

Abstract

本研究提出了一种新型的双显影剂，即成像和治疗性显影剂的合成和表征，旨在提高硼中子俘获疗法(BNCT)在癌症治疗中的疗效。显影剂(Gd-B-AC01)由一个碳硼烷单元(十硼原子)关联胆固醇单元一侧(为了纳入脂质体双层)和Gd (III) / 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane monoamide复杂的另一边(MRI报告获得的量化B / Gd浓度)。为了使BNCT试剂具有特定的传递特性，嵌入MRI/BNCT双探针的脂质体已被聚乙二醇化磷脂功能化，该磷脂在PEG链末端含有叶酸残留。该载体允许脂质体与叶酸受体结合，叶酸受体在许多类型的肿瘤中过度表达，特别是在人类卵巢癌细胞(IGROV-1)中。体外对IGROV-1细胞的实验表明，装载Gd-B-AC01的脂质体是将MRI/BNCT探针递送到肿瘤细胞的有效载体。最后，经BNCT处理的IGROV-1细胞显示，在叶酸靶向GdB10-AC01/脂质体内化后，细胞经照射后存活的细胞数量明显减少。

Introduction

硼中子俘获疗法(BNCT)是一种二元治疗，结合低能中子辐照与靶细胞含硼化合物的存在。这种方法已经被提出用于几种病理，尽管大多数的努力都集中在癌症上。BNCT研究多年，但尚未进入常规临床实践。由于这种处理只对细胞内化大量硼(至少20 - 30ppm)有效，其成功有限的主要原因主要在于NCT化合物对靶细胞的输送不足。局部硼浓度的测量是确定中子最佳辐照时间和计算辐射剂量的关键问题。在临床成功实施BNCT的一个问题是，在治疗前和治疗期间，很难定量地绘制患者中含硼分子的分布。到目前为止，还没有一种非侵入性的方法来评估接受照射的受试者患病和健康组织中的硼浓度。因此，剂量计算是根据事先进行的生物分布研究所得的血液、肿瘤和正常组织中硼含量值计算的。假设肿瘤/血液比例在以前的生物分布研究中被评估，可以在辐照之前甚至在辐照期间采集血液样本来测量组织中硼的浓度。但硼的分布在不同患者之间存在差异，因此肿瘤-血硼浓度比存在较大的不确定性。最近发展的更敏感的成像技术和分子医学协议，基于使用能够携带大量治疗和诊断试剂的位点特异性试剂，可以有助于提高BNCT的疗效和变得更有竞争力与已建立的肿瘤治疗方案。在BNCT研究的化合物中，碳硼烷备受关注，碳硼烷是一种二十面体笼状化合物，含有多个硼原子，可增加硼在肿瘤细胞中的有效载荷。：含硼化合物可进一步用亲油性基团官能化，以便通过与靶向纳米颗粒结合使其特异性和高效地传递。我们的实验室已经开发了用于MRI/BNCT的新型双试剂的合成(AT101)，其中碳硼烷单元与亲脂链连接，并通过酰胺键与Gd-DOTA复合物连接。根据合成设计，亲脂性探针AT101与低密度脂蛋白结合并在肿瘤细胞中聚集，其特征是低密度脂蛋白转运体上调。利用低密度脂蛋白作为生物载体确实是获得肿瘤细胞中每g高浓度B原子以及肿瘤和健康组织之间良好选择性的关键。体内MR图像采集显示，肿瘤区域硼的含量超过了NCT治疗成功所需的阈值。最近，为了简化合成过程，同时保持并可能改善AT101良好的性能，我们设计了一种新的含有三唑连接剂的结构来代替酰胺的功能(MEA/01)。其加合物在B16黑色素瘤细胞上进行了“体外”测试，获得的细胞内Gd/B浓度似乎足以进行进一步的“体内”BNCT研究。

另一种很有前途的方法是使用脂质体来有效地向肿瘤输送含硼药剂。事实上，文献中有许多含有硼化合物的配方被封装在水腔中，或者在与脂质结合后，被纳入脂质体双分子层。一种被称为“长时间循环”聚乙二醇包覆脂质体的特殊脂质体，由于微血管通透性和淋巴引流缺陷，能够在实体肿瘤中积累。被动外渗的程度直接取决于脂质体在血流中停留时间的延长。就内化步骤而言，应该注意的是，在没有受体介导机制的情况下，完整脂质体进入肿瘤细胞的内化不会发生。因此，在没有靶向含硼分子的脂质体活性的情况下，必须首先在肿瘤细胞外基质中释放含硼分子，以使其扩散到细胞内。另外，脂质体对肿瘤细胞的主动靶向显然是一种有前途的策略，以改善药物对肿瘤的递送。为此，脂质体必须与特定配体功能化，配体能够通过肿瘤血管或肿瘤细胞上表达的受体结合和内化。最近,中村和他的同事开发了含有巯基十一氢十二硼酸酯(BSH)的内水腔脂质体，10%的二硬脂基硼脂(DSBL)融入磷脂双分子层。由于脂质体壳内除了水腔内的硼外，还含有硼，所以该系统显得特别有效。此外，他们使用包裹Gd-DOTA的脂质体，通过MRI对10% DSBL脂质体进行体内实时跟踪，观察到肿瘤区域的高信号强度增强。将治疗剂和显像剂作为独立分子使用的缺点是，只有在脂质体完好无损的情况下，它们才能保持相同的生物分布。脂质体降解后，其生物分布会因其大小、亲水性、残留电荷等因素而有所不同。为了克服这一问题，本研究提出了一种双介质，其中成像(Gd-DOTA)和BNCT(碳硼烷)成分是同一分子的一部分。分子与脂质体双分子层的结合是通过与胆固醇残留物的功能化来实现的。胆固醇是脂质体的一种标准成分，双层脂质体通常被引入磷脂配方中，以增加颗粒的稳定性。相比之下，仅含软糖链的复合物，如本课组之前研究的亲本AT101，不能稳定地纳入脂质体二层，复合物可能会随机释放。在生物有机/药物化学和化学生物学领域，胆固醇的模拟合成是一个重要的分子工具。此外，碳硼烷胆固醇衍生物被纳入单细胞脂质体中，显示在肿瘤中选择性定位，它们可能是运送硼到肿瘤部位的有用载体。在这项研究中,脂质体嵌入式与MRI /BNCT双探针功能化聚乙二醇磷脂,含有叶酸残留的最后挂钩链,作为一个特定的载体运输大量的B / Gd双重特工肿瘤细胞,特别是人类卵巢癌细胞过表达叶酸受体。最后，为了提高双剂的效果，将DOTA-monoamide配体与富含157Gd同位素(95%)的钆进行络合，在所有稳定同位素中具有最大的热中子俘获截面(255,000 b)，约为10硼(3838b)的66倍。

Results and discussion
Synthesis of the B/Gd dual agent
由于胆固醇的羟基在空间上受到阻碍且不具有反应性，因此在第一步合成中，通过亲核取代，将其与羟基丙基官能化，从而使其更容易与碳硼烷的笼键连接。如方案1所示，胆固醇被定量转化为相应的甲磺酸(1)(通过检测与甲磺酸CH3相关的1H光谱中2.97 ppm的信号来评估)。中间体1与丙-1,3-二醇在无水二氧烷中在120℃下反应一夜。尽管应用条件苛刻，但由于醇基团的空间位阻，经色谱纯化后的产物收率为27%。酒精2被氧化成相应的羧酸，遵循经典琼斯反应条件，总收率为78%。通过检测与羰基相关的13C光谱中170ppm的共振，证实了3-(胆甾-5-en-3辛基)-丙酸(3，方案1)的形成。（一堆看不懂的化学反应。。。。。。。略过）
Liposome preparation and characterization
略

NMRD profiles
略

Uptake experiments on IGROV-1 cells in vitro and MRI analysis
研究了脂质体对人卵巢癌的体外作用，通过ICP-MS分析测定金属浓度，评估细胞在孵育24小时后吸收Gd的量。这些细胞表达显著水平的FR（叶酸受体） inhibitor(每个细胞0.5-1×106个受体)。脂质体的稳定性表现为无非特异性释放Gd-B-AC01对肿瘤细胞的影响。为此，将细胞在37℃下孵育24小时，在非靶向GdB-AC01/脂质体中孵育，其中GdB-AC01含量增加7.5到15%。

BNCT treatment of IGROV-1 cells
略

Experimental procedures
1H relaxation rate measurements
在Stelar Spinmaster光谱仪(Stelar, Mede, Italy)上通过标准inversion recovery技术(16次实验，2次扫描)测量了水质子的纵向弛豫率，工作频率为21.5 MHz。典型的90度脉冲宽度为3.5 ms, T1数据的重现性为±0.5%（这是什么属性？？？0.5%的数据不能在图像中显示？对比标准是什么？原始数据如何得到）。在快速场循环弛豫仪上测量了从0.00024到0.5 T的连续磁场强度(对应于0.01-20 MHz的质子拉莫尔频率)下水质子的1/T1核磁弛豫分布(NMRD)分布(Stelar Spinmaster FFC 2000;石碑)配备一个银磁铁。弛豫仪在完全的计算机控制下工作，1/T1值的绝对不确定度为±1%。采用典型的场序列:40 ~ 8MHz的non-polarized序列和8 ~ 0.01 MHz的pre-polarized序列。观测场设置13MHz。分别进行两次扫描的16次实验，对每个磁场进行T1测定。

Cell culture and uptake experiments
略，这里都是用质谱仪（ICP-MS）完成采样。

MRI

在1、7t场采集MR图像。使用Aspect M2高性能MRI系统(Aspect Magnet Technologies Ltd, Netanya，以色列)获取1 T时的MR图像，该系统由一个NdFeB磁体组成，配备一个内径35 mm的螺线管Tx/Tr线圈。该系统配备快速梯度线圈(梯度强度，在60A时450 mT/m; 斜坡时间，250 us在160 V)，场均匀性为0.2-0.5高斯。7t时的MR图像由配备Micro 2.5微成像探针的Bruker Avance300光谱仪(德国，Ettlingen, Bruker BioSpin)采集，使用两个内径分别为30和10毫米的birdcage谐振器。

为了在体外记录MR图像，将细胞颗粒置于玻璃毛细血管底部，置于嵌入高胶凝琼脂糖凝胶(1% PBS)的phantom中。使用标准T1加权多层自旋回波序列获取MR图像，使用以下参数: TR/TE/NEX 250/4/6, resolution 78 μm, slice thickness 1 mm at 7 T and TR/TE/NEX 250/7/16,
resolution 78 μm, slice thickness 1 mm at 1 T, respectively. 在两种场强下，使用标准饱和恢复方案测量T1弛豫时间（知道如何获取弛豫时间）。

Cell irradiation
7个烧瓶，4个IGROV-1细胞在叶酸靶向GdAC01/脂质体中孵育24小时，浓度为10uM Gd, 3个未处理的对照组细胞在意大利帕维亚大学的TRIGA Mark II反应器的热柱中辐照。在有脂质体的情况下培养的细胞在照射前用冷PBS洗涤。在辐照结束时，培养基被移除，用RPMI代替，烧瓶放置于37℃，在5% CO2的湿化大气中。