细胞培养--消化

距上次写的博客已经9天了，这就九天里写了一份近9000字的开题报告，完成了开题答辩，冻存了一批细胞，PC12和SY5Y仍在增殖中，参加了中国康复医学综合年会。
先来说说细胞培养的相关情况：SY5Y细胞长势良好，来到天津的第二天就1：3传代了一次，传代后生长旺盛。北京细胞中心发送细胞的培养瓶是装满培养液的，收到细胞后，把培养液收集了起来，并用这些培养液培养了第一批冻存的细胞。这样做的目的是为了保存一批症状最接近原始状态的细胞。当细胞增殖至9瓶（T25）时，计数后调整密度，将其中的7瓶冻存六密度分别为4-6百万/ml。剩余的两瓶，继续培养，将原装培养液与我们自己新配的培养液混合使用，以便于细胞能够更好的适应培养液的变化。11.16号1：2传代，11.17换液，今天共有4瓶SY5Y在培养，密度在50%左右，预计21号之前再次传代。PC12的培养也取得了重大进展，两瓶细胞生长旺盛且形态良好。11.14进行1：2传代，11.16其中2瓶再次传代。
近期传代操作中，意识到一个关键技术：消化程度的把握。PC12与SY5Y都是贴壁生长的细胞，之前查看的文献认为PC12贴壁疏松，但也需要消化。先说PC12：刚开始培养的PC12，因使用的不是马血清而是牛血清，增殖不明显，细胞形态差，存在分化现象。换了血清后，状态好转，增殖后便开始传代。因认为该细胞贴壁疏松，消化时使用不含EDTA的胰酶（含有EDTA的胰酶消化能力更强），时间把握不准，细胞成片脱落，不易吹散。换了新鲜溶液，显微镜下观察发现存在成团现象。成团细胞内部的细胞营养吸不进去，废物排不出来，很快就会凋亡。凋亡细胞裂解后，细碎的细胞质附着在其他细胞上，在显微镜下显示为小颗粒状黑点，这无疑是不利于健康细胞生长的。丁香园上有同仁认为直接吹打相对于胰酶消化后吹打对细胞的损伤更小。为了解决消化程度把握不准的问题，再次传代时，我将尝试单纯吹打进行穿代和缩短消化时间增加吹打力度两种方式。再来说说SY5Y：该细胞成上皮样，贴壁牢固，细胞中心建议对T25瓶培养的细胞加1-2ml含有EDTA的胰酶进行消化。第一次传代时，加了含有EDTA的胰酶后，未来得及显微镜下观察的时候，细胞已成片脱落，便立刻加培养液终止消化。离心后加大了吹打力度，效果仍不理想。再次传代时，我将注意把握消化时间，我预计消化时间在15S左右比较恰当。将使用手机或计时器进行准确计时。
11.14号对2只PC12传代时，我印象中消化时间和吹打程度相差无几，一只细胞分散且分布均匀，而另一只则多成团。细胞传代过程消化程度的把握需要经验，包括添加的胰酶的量、消化时间、吹打时间和吹打力度等。传代后的细胞若因消化不当出现成团现象，严重影响细胞的生长，且影响深远，至少持续带下一次传代之后。