分化成功的标志及特异性神经递质的检测

于SY5Y分化过程中施加rTMS，当其分化成功后，检测动作电位（active potential， AP）。检测AP前存在一个关键的问题----SY5Y 分化成功的鉴定。
近期读的文章，多是关于agent诱导SY5Y分化的。我着重关注了诱导分化的具体步骤和检测的物质。就目前接触到的文章而言，提到的成熟神经元的标志物包括但不局限于：生长相关蛋白（growth-associated protein ，GAP-43)、 神经元核抗原（neuronal nuclei ，NeuN),、突触素蛋白（synaptophysin ，SYN)、突触泡蛋白（synaptic vesicle protein II ，SV2)、突触相关蛋白-97（SAP–97）、 神经特异性烯醇化酶（neuron specific enolase ，NSE) 、 微观相关蛋白（icrotubule associated protein ，MAP)和神经丝蛋白（Tau）。尽管不同的研究者测量的指不同，但上述物质是神经元特异性标志是公认的。RA诱导SY5Y分化前后，通过化学免疫染色发现，SY5Y分化后神经特异性烯醇化酶（neuron specific enolase ，NSE)分布状态发生变化。由原来主要分布于细胞体质中，后在胞体和突触中的分布增加；或分化后染色呈阳性。分化后，胞体和神经突处的突触素蛋白（synaptophysin ，SYN)荧光强度显著增加。分化后，胞体和神经突处的突触相关蛋白-97（SAP–97）荧光强度显著增强；神经丝蛋白（Tau）分化前几乎不存在，分化后显著增加。多篇文章提到NeuN/MAP2是成熟神经元的特异性物质，分化后的SY5Y用514抗体染色显示，分化的SY5Y细胞与原代培养神经元几乎相似，western-blot检测MAP2的含量发现，分化后其含量显著增加。
从形态学上分析，分化后的SY5Y拥有广泛的神经突。一般认为，当突起长度大于50μm时，认为该细胞分化成功。
综上所述，接下来的实验中，可以生化方面选择MAP2、SYN作为测量指标，通过染色观测其分布鉴别分化成功与否；从形态学的角度讲，在尼康倒置显微镜下观测细胞形态，测量神经突起的长度判断细胞分化状态。
总体的实验思路是从宏观到微观，先探究rTMS对神经细胞增殖、分化、凋亡的作用。涉及到的实验技术包括MTT增殖检测、HE染色、免疫荧光染色、电生理膜片钳等。下一步探究具体的分子机制，包括各种特异性物质的表达水平等。前期的实验只需将SY5Y诱导为神经元细胞即可，后期的实验因不同的诱导剂介导不同的神经表型，因此要注意诱导剂的选择。
3月13号之前需要解决的问题是：
1. 确定要检测的物质；
2. 查看实验技术及需要的药品、试剂等；
3. SY5Y诱导分化的具体操作：RA的配制、培养基中血清浓度的选择、RA诱导时间；
4. rTMS刺激参数的选定；