转录组问题汇总

转录组测序不同重复之间的相关性多少合适？测序的深度如何把握？

p > 0.05 ；相关系数r>0.95
测序深度，是测序量除以基因组的长度，例如测序深度10，就相当于测了10次全基因组，50就是测了50次。

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测序reads数和测序碱基数之间如何换算？

“单端测序” :数据量=reads 长度 * reads个数
（reads长度很容易得知，reads数目可以用￥wc -| file.fastq统计出来的结果除以4，因为1个reads在fastq文件里通常
是用4行信息描述。）

“双端测序”:数据量=单端reads长度单端reads个数2
单位换算：1个碱基=1bp，1kb=1024bp，1M=1024kb，1G=1024M
测序深度的计算方法：测序深度=数据量大小/参考基因组大小

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转录组测序的过程，从样本准备到获取测序数据？

a.样品的获得：培养细胞，或者从组织上进行显微解剖，必要时可以利用流式细胞仪获取细胞，注意对照组和重复样品的制备。
b.氮液研磨：加入裂解液对细胞进行裂解，通过低温高速离心获取大量核酸的上清。加入含有oligo dT引物和RNA >inhibitors以及转录酶系，在合适的温度下进行逆转录，获得cDNA文库，进行第二链的合成。
c.利用covaris或者fragment酶进行打断，末端修复，A-tailing ，Adaptors，index引物进行文库扩增。磁珠纯化进行片段大小的筛选。
d.选择合适的平台进行测序，主流测序仪有hiseq2500，4000，xten等。
e.下机数据BCI格式，进行index分选并转为fastq格式，进行质检和后续的分析。

转录组分析的流程，列举出每步可用的工具、每步分析的意义？

测序质量评估：查看公司报告，可去除接头序列、低质量碱基Trimmomatic软件
构建基因组索引：Ensembl提供的参考基因组基因注释文件STAR工具
reads比对：看RNA来源（STAR）
评估比对质量：IGV使用samtools和UCSC系列工具
合并表达文件
转录本拼接：StringTie转录本拼接
分析GO富集分析和GSEA富集分析

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